[发明专利]胶质瘤细胞中GDNF基因启动子检测方法

摘要

本发明公开了一种胶质瘤细胞中GDNF基因启动子检测方法，步骤一：提取胶质瘤细胞；步骤二：细胞培养；步骤三：药物处理；步骤四：mRNA提取；步骤五：反应：95℃预变性30s；95℃变性20S，60℃退火15s;72℃延伸15s，扩增40个循环；步骤六：计算：样品以GAPDH基因的mRNA表达作为内参照，通过相对定量(2‑△△CT)法计算目的基因在各样品中相对mRNA的表达水平。引物的序列为：GAPDH：F:5’TCCCTCAAGATTGTCAGCAA3’；R:5’AGATCCACAACGGATACATT3’GDNF:F:5’GACTTGGGTTTGGGCTACGA3’；R:5’TGGTAAACCAGGCTGTCGTC3’。通过本发明通过本发明处理过程后，经过检测的胶质瘤细胞2^‑△△CT表达水平更高，同时通过两者方差对比，本发明的检测方法，2^‑△△CT的表达水平更加稳定。

主权项

一种胶质瘤细胞中GDNF基因启动子检测方法，其特征在于：步骤一：提取胶质瘤细胞：取48h内的胶质瘤样本，首先剪碎并用清洗，加入0.25 %胰酶溶液在37℃条件下消化5min；收集细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，每周换液两次；在原代培养7‑9天后，将培养瓶置于恒温摇床37℃，200rpm，20h震荡纯化，以去除小胶质细胞及少突胶质细胞；经GFAP 免疫荧光鉴定阳性的细胞视为成熟的细胞，取第4代的处于对数生长期为胶质瘤细胞株；步骤二：细胞培养：胶质瘤细胞株用含10%胎牛血清、100U/ml 青霉素，100U/ml链霉素的培养基，置于37℃，5% CO2培养箱中培养；步骤三：药物处理：取对数生长期细胞培养24 h同步化后进行药物处理，加入终浓度为25~100μmol/L的姜黄素继续培养24h；步骤四：mRNA提取，采用TRIzol一步法从细胞中提取总 RNA，取RNA模板2μg用Prime Script II逆转录试剂盒行逆转录反应合成cD‑NA第一链，再以逆转录反应液1μl作为模板，加入相应引物进行PCR扩增，所述引物的序列为：GAPDH：F:5’ TCCCTCAAGATTGTCAGCAA3’      R:5’ AGATCCACAACGGATACATT3’GDNF: F:5’ GACTTGGGTTTGGGCTACGA3’      R:5’ TGGTAAACCAGGCTGTCGTC3’；步骤五：反应：95 ℃预变性30s；95℃变性20S，60℃退火15s; 72℃延伸15s，扩增40个循环；步骤六：计算：样品以GAPDH 基因的mRNA表达作为内参照，通过相对定量 (2^‑△△CT) 法计算目的基因在各样品中相对mRNA的表达水平。