[发明专利]一种脂肪干细胞的纯化方法及干细胞在成骨诱导及成软骨诱导上的应用

摘要

本发明提供一种脂肪干细胞的纯化方法，该方法包括：原代脂肪干细胞培养和CD90+细胞群纯化。本发明还提供纯化后的脂肪干细胞在成骨诱导和成软骨诱导方面的应用。通过本发明得到的ADSCs中CD90+细胞群，具有更高的干细胞分化潜能，可以提高ADSCs在组织工程中的使用效率和修复效果，在相同诱导条件下，成骨率和成软骨率分别提高了3‑5倍和5‑7倍。

主权项

1.一种脂肪干细胞的纯化方法，其特征在于：所述的纯化方法按如下步骤进行：(1)原代脂肪干细胞培养：取兔源腹股沟处脂肪块置于含100U/ml青霉素‑链霉素的PBS中，去掉筋膜和血管，加胶原酶II剪碎，37℃消化2小时，离心，沉淀用含体积浓度10％血清的DMEM‑L培养基重悬，37℃，5％CO₂孵箱培养，每3天换液一次，待细胞长至80％时传代，传代1‑5次，获得原代脂肪基质细胞的培养液；(2)CD90+细胞群纯化：弃掉步骤(1)原代脂肪基质细胞的培养液，用步骤(1)中的PBS清洗一次后再加入PBS，然后用细胞刮刀将细胞刮下，收集于离心管，1500rpm，3min离心，弃上清，加入4℃预冷的PBA溶液，1500rpm，3min离心，弃上清，加入鼠抗兔CD90一抗PBA溶液，4℃孵育2小时，1500rpm，3min离心，弃上清，PBS清洗2次，加入抗鼠的FITC标记的荧光二抗的PBA溶液，4℃孵育30min，1500rpm，3min离心，弃上清，PBS清洗2次后用PBS重悬，采用流式细胞仪收集CD90+细胞群，获得纯化后的脂肪干细胞；所述鼠抗兔CD90一抗PBA溶液中鼠抗兔CD90一抗与PBA体积比为1:100；所述PBA溶液为含体积浓度0.5％胎牛血清的PBS；所述抗鼠的FITC标记的荧光二抗PBA溶液中FITC标记的荧光二抗与PBA体积比为1:200。