[发明专利]一种基于胶原制备组织工程表皮的方法

摘要

本发明公开了一种基于胶原制备组织工程表皮的方法，采用人表皮干细胞作为种子细胞，以经过牛胎盘I型胶原构建的3D无细胞基质作为支架，利用添加MMPs抑制剂的CELLnTEC培养系统，气液界面分离法构建为一种有活性的全层组织工程表皮。与现有技术相比，本发明本发明利用通过分化培养基中添加MMPs抑制剂marimastat 5nM，有效减少了支架和人工表皮产品的收缩。利用I型牛胶原3D支架结合CELLnTEC培养系统，能够维持表皮干细胞的增殖和分化，不使用成纤维细胞，有效减少了人工表皮产品制备过程中的工作量和操作步骤。

主权项

一种基于胶原制备组织工程表皮的方法，其特征在于：采用人表皮干细胞作为种子细胞，以牛I型胶原构建的3D基质作为支架，利用气液界面分离培养法复合构建为一种有活性的全层组织工程表皮，具体包括如下步骤：(1)表皮干细胞的分离和培养：取同种皮肤组织小块，含双抗的PBS反复冲洗，置Dispase Ⅱ中浸泡过夜，冷消化分离真皮、表皮，收集表皮皮片，剪为碎块，胰酶热消化，分离表皮干细胞，过滤并接种于I型牛胶原包被的培养皿中，通过专用选择培养基筛选表皮干细胞；(2)I型牛胶原3D支架制备：准备接种前1天，制备3D牛胶原支架，胶原配置：7.5ml 1.5mg/mL I型牛胶原溶液10ml，1mL 10×DMEM，0.5mL NaHCO₃，1mL 200mM Hepes，0.1mL 1M NaOH，配制在低温下进行，配制好后37℃条件下凝固30min，待胶原成固体后，缓慢添加PBS或基础培养基置于培养箱中过夜，平衡PH；(3)接种表皮干细胞：次日，吸弃培养板中平衡溶液待用，获取培养至70％～80％融和状态的P2代角质形成细胞，以Transwell培养小室作为气液分离支架，支架上，接种6×10⁵细胞数量于24mm的嵌套培养皿的上室中，上室中添加Cnt‑07,CELLnTEC培养基2ml，下室中添加Cnt‑07,CELLnTEC培养基3ml继续培养2天待细胞100％汇合成片；(4)气液分离培养构建组织工程皮肤：更换添加MMPs抑制剂marimastat 5nM，的角质细胞分化Cnt‑3D,CELLnTEC培养基继续培养2天，接种后第5天，将24mm的嵌套培养皿上室中液体吸出，保持细胞表面干燥，下室添加角质细胞分化Cnt‑3D,CELLnTEC培养基0.8mL，液面不高于表皮细胞层，每天换液，至12天角化表皮结构形成，即完成组织工程皮肤的制备过程。