[发明专利]核苷酸序列、通用反向引物、通用反转录引物、引物设计方法及miRNA检测方法

摘要

本发明提供一种具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列、具有SEQ ID NO:2的通用反向引物、通用反转录引物、引物设计方法以及miRNA检测方法。在miRNA检测方法中，使用所述通用反转录引物对miRNA样品进行cDNA合成，而所述通用反向引物用于在qPCR定量检测时进行所述cDNA分子扩增。所述引物设计方法使用所述通用反向引物序列、所述核苷酸序列及设计规则，以设计qPCR定量检测所用的引物。本发明的通用反转录引物、通用反向引物以及由引物设计方法所设计出的引物具有较佳的特异性及敏感度，同时兼具降低成本及方便使用的特性，且不需对引物进行额外修饰。

主权项

1.一种引物设计方法，所述引物用于miRNA qPCR检测，包括：/n确认待测miRNA与同物种中的其他miRNA之间的序列相似度，/n当序列相似度低于90％时，以第一设计方法设计正向引物，所述第一设计方法包括：/n第一调整步骤，使正向引物与SEQ ID NO:2所示的通用反向引物之间的Tm值差异不超过2度，当正向引物的Tm值低于57℃时，在正向引物的5’端按照SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列依序每次增加一个核苷酸，以使正向引物的Tm值达到57℃至61℃；以及/n第一确认步骤，确认正向引物的二聚体的△G大于-7.5千卡/摩尔，/n其中当二聚体的△G小于-7.5千卡/摩尔时，删减二聚体区域的正向引物序列，以避开形成二聚体的区域，并重新进行所述第一调整步骤及所述第一确认步骤，/n当序列相似度高于90％时，以第二设计方法设计正向引物及反向引物，所述第二设计方法包括：/n重叠设计步骤，比对待测miRNA与同物种中的其他miRNA之间的核苷酸差异位置，并使正向引物及反向引物的3’端的最后一个核苷酸残基设计至所述核苷酸相异位置上，若仍无法区分待测miRNA与同物种中的其他miRNA，将正向引物或反向引物再往前增加一个重叠的碱基，或将正向引物和反向引物同时再增加一个重叠的碱基；/n第二调整步骤，使正向引物与反向引物之间的Tm值差异不超过2度，当正向引物的Tm值低于55℃时，在正向引物的5’端按照SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列依序每次增加一个核苷酸，当反向引物的Tm值低于55℃时，在反向引物的5’端按照SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列依序每次增加一个核苷酸，以使正向引物与反向引物的Tm值达到55℃至61℃；以及/n第二确认步骤，确认正向引物及反向引物的二聚体的△G大于-7.5千卡/摩尔，/n其中当二聚体的△G小于-7.5千卡/摩尔时，更换增加于正向引物5’端的SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，以避开形成二聚体的区域，并重新进行所述第二调整步骤及所述第二确认步骤，/n当所述第二设计方法无法避开形成二聚体的区域时，若二聚体问题是由反向引物造成，进行第三设计方法，若二聚体问题是由正向引物造成，进行第四设计方法，/n所述第三设计方法包括：/n延长正向引物的3’端长度并缩短反向引物的3’端长度，以避开形成二聚体的区域，/n其中所述核苷酸差异位置设计在正向引物或反向引物的3’端的最后四个核苷酸内，且在缩短反向引物的3’端长度后，若Tm值不足，则在反向引物的5’端按照SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列依序每次增加一个核苷酸，/n所述第四设计方法包括：/n延长反向引物的3’端长度并缩短正向引物的3’端长度，以避开形成二聚体的区域，/n其中所述核苷酸差异位置在正向引物或反向引物的3’端的最后四个核苷酸内，且在缩短正向引物的3’端长度后，若Tm值不足，则在正向引物的5’端按照SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列依序每次增加一个核苷酸，/n其中以所述第一设计方法设计出的正向引物与SEQ ID NO:2所示的通用反向引物在qPCR定量检测中进行cDNA分子扩增。/n