[发明专利]一种测定血浆中N1-甲基尼克酰胺浓度的LC-MS-MS方法

摘要

本发明公开了一种测定血浆中N1‑甲基尼克酰胺(N1‑MNA)浓度的LC‑MS‑MS方法，于1.5mL塑料离心管中加入血浆样品50μL，加入30ng·mL‑1内标N’‑甲基尼克酰胺(N’‑MNA)溶液20μL，再加入160μL乙腈，旋涡振荡2min，离心后吸取上清液进行LC‑MS‑MS分析。本发明建立了N1‑MNA在人体内的测定方法，与文献报道的方法相比，本方法前处理更加简便，定量下限更低，分析时间更短，使用血浆样本量更少，为研究N1‑MNA与肥胖、糖尿病和冠心病的相关性，发现新的生物标志物，提高临床预防和诊疗水平提供技术支持。

主权项

1.一种测定血浆中N1‑甲基尼克酰胺浓度的LC‑MS‑MS方法，其特征在于，它包括如下步骤：(1)血浆样品预处理：于1.5mL塑料离心管中加入血浆样品50μL，加入30ng·mL‑1内标N’‑甲基尼克酰胺溶液20μL，再加入160μL乙腈，旋涡振荡2min，离心后吸取上清液进行LC‑MS‑MS分析；(2)随行标准曲线样品的制备：取1.5mL塑料离心管数支，加入空白血浆50μL，分别加入不同浓度的N1‑甲基尼克酰胺标准溶液10μL，旋涡10s混匀，配成含N1‑甲基尼克酰胺的浓度分别为80，40，20，10，5，2.5ng.mL‑1的含药血浆；加入内标N’‑甲基尼克酰胺溶液20μL，再加入150μL乙腈，旋涡振荡2min，离心后吸取上清液进行LC‑MS‑MS分析；(3)液相色谱条件为：色谱柱：Waters Spherisorb CNRP，4.6×150mm，5μm；流动相：A：含0.1％(v/v)甲酸和5mM/L甲酸铵的水溶液；B：乙腈；梯度洗脱见表1；流速：200mL.min‑1；柱温：35℃；进样体积：3μL；表1时间A∶B体积比百分比％0min55∶453.3min90∶103.6min90∶103.7min55∶455.5min55∶45(4)质谱测定条件为：离子源：电喷雾离子化电离源ESI；离子检测方式：多反应监测；离子极性：正离子；离子源毛细管电压：4000V；离子源温度：350℃；干燥气：10L/min；雾化气：20psi；检测对象的离子选择通道：N1‑MNA，[M+H]+，m/z 137.1→94.1，fragmentor：100V，collision energy：20V；内标N’‑MNA，[M+H]+，m/z 137.1→80.1，fragmentor：100V，collision energy：25V；(5)计算：采用内标法，以样品N1‑甲基尼克酰胺和内标N’‑甲基尼克酰胺的峰面积比值代入随行标准曲线方程，计算N1‑甲基尼克酰胺的血浆浓度；步骤(2)中，所述的空白血浆为病毒灭活冰冻血浆，抗凝剂为枸橼酸钠。