[发明专利]人膀胱移行细胞癌细胞系及膀胱癌组织重组功能性重建模型的建立方法

摘要

本发明公开了一种人膀胱移行细胞癌细胞系及膀胱癌组织重组功能性重建小鼠模型的建立方法，包括原代细胞培养、永生化细胞系鉴定、组织重组和种植、HE染色、免疫组织化学等步骤。本发明建立了一株稳定的新型人膀胱移行细胞癌细胞系，并利用该细胞系构建了膀胱癌组织重组功能性重建小鼠模型，在小鼠体内模拟人膀胱癌的发生和发展过程，从体外分子和细胞生物学以及体内动物模型等，研究膀胱癌生物学行为，为发现新的生物标记物和治疗措施提供有效的研究工具。

主权项

一种人膀胱移行细胞癌细胞系的建立方法，其特征是：包括下列步骤：（1）原代细胞培养将新鲜人膀胱癌手术标本无菌下取材并放在15mL无菌离心管，加入10ml原代细胞培养液，4℃保存；将标本分为两部分，一部分用4%多聚甲醛固定，留作HE染色和病理确诊；另一部分用剪刀剪碎，1×PBS清洗3遍，将剪碎的组织块转移到离心管中，离心后，用原代培养液重悬，放入T‑25原代培养瓶中，放在5%CO₂、37℃恒温培养箱中培养；每天在倒置显微镜下观察组织块的生长状态；培养1‑2天后，当组织块粘附在瓶底后，换液，继续用原代培养液培养；当原代细胞从组织块周围长出后，用胰蛋白酶将细胞消化，在显微镜下观察，当细胞形态变成透明圆球状时，加入血清，终止消化，用移液器轻轻吹打细胞，使其悬浮；将培养瓶中的液体移入离心管，离心，收集细胞沉淀，去除上清液，加入原代培养液，放入新的培养瓶中培养，得到人膀胱癌组织原代尿路上皮细胞；用胰酶充分消化生长出的细胞，继续培养细胞并传代10‑20次，放入T‑25细胞培养瓶，改换常规细胞培养液进行培养，实现细胞永生化；（2）细胞系鉴定免疫印记：用蛋白裂解液：RIPA裂解液:PMSF=100:1，收集细胞蛋白样品，为确保蛋白上样量一致，经BCA蛋白定量法调整蛋白浓度为2ug/ul；在蛋白样品中加入浓缩的SDS‑PAGE蛋白上样缓冲液，沸水浴5min；配制10%SDS‑PAGE凝胶，按每孔25ul上样，进行蛋白恒压电泳，浓缩胶电压80V，分离胶电压100V；电泳结束后，PVDF膜恒流转膜，260mA，2h；取出PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭2h；孵育一抗，4℃，过夜；洗膜后加入二抗HRP标记；ECL显影剂显影；扫描;免疫荧光：取对数生长期细胞，胰酶消化后，接种于经多聚赖氨酸包被盖玻片的24孔培育板内，孔内放入盖玻片，放在孔底，使细胞爬在盖玻片上；细胞密度约10^4/孔；放置过夜，待细胞完全贴壁，细胞长满至60%时，细胞形态正常后，弃培养液，4%多聚甲醛固定30min，0.2%Triton X‑100破膜5min，5% 小牛血清封闭 30min，用移液器吸出血清，滴加一抗，4℃孵育过夜；用1×PBS冲洗5min×3次；滴加荧光素标记二抗，室温孵育2h，PBS冲洗5min×3次，DAPI复染盖片；荧光显微镜下观察并拍照。