[发明专利]一种基于rpoB基因鉴定高同源性海洋弧菌的方法

摘要

本发明公开了一种基于rpoB基因鉴定高同源性海洋弧菌的方法。本发明首先通过分析海洋弧菌种间rpoB基因序列，设计了海洋弧菌rpoB基因特异性引物。然后以50株海洋弧菌的基因组DNA为模板，利用上述引物，选择适宜的扩增体系和扩增条件进行PCR扩增，结合测序技术实现对海洋弧菌的快速准确鉴定。利用该方法可对同源性高的海洋弧菌进行检测，简单快速，正确率高，克服了目前16S rRNA测序鉴定正确率低的问题。本发明可用于水体和临床样品的监督和检测、海洋弧菌的流行病学调查及进化分析等，涉及临床诊断、水产养殖、食品安全等领域，具有深远的社会效益和较大的经济效益。

主权项

一种基于rpoB基因鉴定高同源性海洋弧菌的方法，其特征在于，包含以下步骤：1）细菌复苏与培养：在超低温冰箱中取出待复苏菌株，核对菌株编号后，用无菌牙签挑取适量固体冻存物于2216E培养基，采用三区划线法进行接种，将平板置于28℃培养箱中培养16‑18小时；2) 煮沸法提取细菌基因组DNA：无菌EP管中加入50µl无菌水，挑取单个菌落于其中充分混匀，调制菌液至1‑2浊度，震荡15秒钟；置100℃沸水中煮沸10min，取出后于冰上放置10分钟；13000转离心5分钟，取上清液约30μl即为DNA提取液；3) PCR扩增：其核苷酸序列为：VF 5’AGGCGTGTTCTTCGACAGCGATAA3’；VR 5’TCGTCCACTTCGCCTTTACC3’； PCR扩增体系为：2×PCRmix Taq                 25µl；10μM引物VF                    1µl；10μM引物VR                    1µl；ddH2O                         20µl；DNA模板                       1µl；PCR反应参数为：94 ℃ 8 min；94 ℃ 40 s，55 ℃40 s，72 ℃ 1 min 30 s，循环30次；72 ℃ 8 min，产物4℃保存；4）琼脂糖凝胶电泳检测将上样梳固定于胶槽内，将制备好的胶液倒入胶板内，使胶液缓慢展平，确保没有气泡后，将胶槽于室温放置使胶液完全凝固；胶液完全凝固后，将凝胶置于电泳槽内，添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板1‑2mm；取9µlPCR产物与1µl 10×loading buffer混匀后，加入胶孔内，100V电泳30分钟；将电泳后的凝胶于紫外线下观察， rpoB基因的条带位于800bp左右；取阳性结果PCR产物测序；5） PCR扩增产物测序结果分析比对：采用PCR扩增产物直接测序后，序列的5’端和3’端的序列可靠性较低；在5’端和3’端分别去除30bp和40bp，然后采用NCBI中blast软件进行序列比对；在blast结果中，当Identification超过99%时，认为该菌与“Description”中提供的相应菌株名称相符。