[发明专利]一种KRAS基因超低频突变检测试剂盒

摘要

本发明公开了用于检测待测核酸样本目标区域的引物组合物及其应用，其中待检测核酸样本为双链DNA，包括第一链和与第一链互补的第二链，该引物组合物包括：通用引物组，所述通用引物组包括第一通用引物和第二通用引物，所述第一通用引物用于构成测序文库的5’端，所述第二通用引物的靶点位于待检测核酸样本的两条链上目标区域的5’端，用于构成测序文库的3’端；上游引物组，所述上游引物组包括第一上游引物组和第二上游引物组；以及下游引物组，所述下游引物组包括第一下游引物组和第二下游引物组。该引物组合物能够有效地用于检测待测核酸样本目标区域的序列信息，尤其是超低频突变的检测，且检测灵敏度高，结果准确可靠。

主权项

1.一种构建待测核酸样本的目标区域检测文库的方法，其特征在于，利用引物组合物，通过PCR扩增富集所述待测核酸样本目标区域的序列，所述待检测核酸样本为双链DNA，包括第一链和与第一链互补的第二链，所述引物组合物包括：通用引物组，所述通用引物组包括第一通用引物和第二通用引物，所述第一通用引物用于构成测序文库的5’端，所述第二通用引物的靶点位于待检测核酸样本的两条链上目标区域的5’端，用于构成测序文库的3’端；上游引物组，所述上游引物组包括第一上游引物组和第二上游引物组；以及下游引物组，所述下游引物组包括第一下游引物组和第二下游引物组；其中，所述第一上游引物组、第二上游引物组、第一下游引物组和第二下游引物组均包含n条目标区域特异性引物，且必须满足下列条件：(1)所述第一上游引物组和所述第二上游引物组的各上游引物均同向延伸，靶点均位于待检测核酸样本的第一链上目标区域的3’端；所述第一下游引物组和所述第二下游引物组的各下游引物均同向延伸，靶点均位于待检测核酸样本的第二链上目标区域的3’端；(2)n＝1‑5的任意整数，以n＝5为例，设所述第一上游引物组的各特异性引物分别为：N₁、N₂、N₃、N₄、N₅，所述第二上游引物组的各特异性引物分别为：M₁、M₂、M₃、M₄、M₅，所述第一下游引物组的各特异性引物分别为：B₁、B₂、B₃、B₄、B₅，所述第二下游引物组的各特异性引物分别为：P₁、P₂、P₃、P₄、P₅，以特异性引物的靶点与目标区域之间的距离为衡量标准，各特异性引物之间的距离远近关系为：N₁>N₂>N₃>N₄>N₅；M₁>M₂>M₃>M₄>M₅；N₁>M₁；N₂>M₂；N₃>M₃；N₄>M₄；且N₅>M₅，B₁>B₂>B₃>B₄>B₅；P₁>P₂>P₃>P₄>P₅；B₁>P₁；B₂>P₂；B₃>P₃；B₄>P₄；且B₅>P₅；所述方法包括：对待测核酸样本进行预扩增，并将预扩增产物均分为2份，分别作为第一预文库和第二预文库；利用第一上游引物组和第二通用引物对所述第一预文库进行第一PCR扩增，然后利用第二上游引物组和第二通用引物对第一PCR扩增产物进行第二PCR扩增，以便获得第二PCR扩增产物；同时，利用第一下游引物组和第二通用引物对所述第二预文库进行第三PCR扩增，然后利用第二下游引物组和第二通用引物对第三PCR扩增产物进行第四PCR扩增，以便获得第四PCR扩增产物；以及混合所述第二PCR扩增产物和所述第四PCR扩增产物，并利用第一通用引物和第二通用引物对所述混合物进行第五PCR扩增，以便获得第五PCR扩增产物，所述第五PCR扩增产物构成所述待测核酸样本的目标区域检测文库。