[发明专利]一种重组人隐花色素蛋白I（hCRY1）的生产工艺及其组合物

摘要

本发明涉及一种重组人隐花色素蛋白I（hCRY1）的生产工艺及其组合物，所述生产工艺步骤包括：将hCRY1基因克隆至pET‑28a得到重组载体pET‑28a（+）‑hCRY1；将重组载体导入大肠杆菌E.coli BL21（DE3）并筛选得到基因工程菌BL21‑hCRY1‑b；将BL21‑hCRY1‑b在发酵罐中培养及重组蛋白诱导表达；收集和洗涤包涵体；包涵体变性溶解；蛋白亲和层析纯化；蛋白梯度透析复性；蛋白超滤浓缩及溶液置换，得到重组的hCRY1蛋白。该生产工艺的hCRY1产率在200‑300 mg/L，远高于目前已知的其他hCRY1生产方法。

主权项

一种重组人隐花色素蛋白I（hCRY1）的生产工艺，其特征在于，包括以下步骤：（1）构建重组表达质粒：将hCRY1基因片段重组至原核表达载体pET28a(+)，获得重组表达质粒pET28a(+)‑hCRY1；（2）构建工程菌：将重组表达质粒pET28a(+)‑hCRY1转入感受态宿主细胞E.coli BL21(DE3)，然后通过SDS‑PAGE筛选hCRY1表达量高的克隆菌株BL21‑hCRY1‑b；（3）工程菌培养及重组蛋白诱导表达：使用发酵罐培养BL21‑hCRY1‑b，培养温度36.5‑37.5℃，溶氧20‑40%，pH6.8‑7.4，搅拌速度200‑350 rpm，培养5‑8 h后，OD₆₀₀=7‑8时，加入IPTG诱导培养3‑4 h；（4）包涵体收集和洗涤：3000‑5000 rpm离心收集菌体，以功率200‑250 W、工作时间3‑8 s、间歇时间5‑10 s的条件超声破碎菌体60‑90 min，3000‑5000 rpm离心50‑80min，收集包涵体沉淀，用组分含10‑100 mM Tris、0.1‑1.0 mM EDTA、0‑100 mM NaCl、1‑10% Triton X‑100、1‑2 M Urea，pH7.5‑8.5的洗涤缓冲液重悬包涵体，以功率100‑150 W、工作时间3‑8 s、间歇时间5‑10 s的条件超声洗涤60‑90 min，12000‑14000 rpm离心60‑90 min收集沉淀；（5）包涵体变性溶解：用组分含4‑8 M 盐酸胍、pH7.5‑8.5磷酸缓冲液重悬洗涤后的包涵体沉淀，以功率200‑250 W、工作时间3‑8 s、间歇时间5‑10 s的条件超声促溶60‑90 min；再用含6‑8 M Urea、pH7.5‑8.5磷酸缓冲液稀释6‑10倍，以功率200‑250 W、工作时间3‑8 s、间歇时间5‑10 s的条件超声促溶60‑90 min，获得蛋白变性溶解溶液；（6）蛋白亲和层析纯化：将蛋白变性溶解溶液12000‑14000 rpm高速离心40‑60 min，收集上清，经0.22‑0.45 μm滤膜过滤，添加咪唑至滤液中咪唑终浓度为5‑30 mM，以上样体积1‑1.5 CV、上样流速5‑10 ml/min、洗脱流速10‑20 ml/min进行HIS标签亲和层析，用缓冲液0‑500 mM NaCl、6‑8 M Urea、0‑60 mM咪唑、pH7.5‑8.5平衡2‑4 CV，用缓冲液0‑500 mM NaCl、6‑8 M Urea、200‑300 mM咪唑、pH7.5‑8.5洗脱2‑2.5 CV，收集洗脱蛋白峰；（7）蛋白梯度透析复性：将收集的蛋白洗脱峰样品进行梯度透析复性，缓冲液包含0‑6 M Urea、0‑20%甘油、0‑1 M NaCl、0‑100 mM Tris、0‑400mM Arginine、0‑10mM EDTA、0‑10mM GSH，0‑5mM GSSG，pH7.5‑8.5；（8）蛋白超滤浓缩及溶液置换：使用30‑50 KDa超滤膜包对透析所得样品进行超滤浓缩：将样品浓缩至原体积1/4‑1/5后，逐步添加包含0‑100 mM Tris，0‑200 mM NaCl，0‑20%甘油，pH7.5‑8.5的置换缓冲液进行稀释，最后将样品体积浓缩至原体积的1/5，得到可溶的hCRY1蛋白溶液，再经0.22 μm滤膜过滤后，即得到可溶性hCRY1蛋白溶液；所述hCRY1的氨基酸序列如SEQID NO：1所示。