[发明专利]一种葡萄夏黑的基因转化方法有效
申请号: | 201610394498.3 | 申请日: | 2016-06-06 |
公开(公告)号: | CN105861546B | 公开(公告)日: | 2019-04-30 |
发明(设计)人: | 王媛花;颜志明;郭正兵;王全智;杨宝林;董慧 | 申请(专利权)人: | 江苏农林职业技术学院 |
主分类号: | C12N15/84 | 分类号: | C12N15/84;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/88 |
代理公司: | 南京苏高专利商标事务所(普通合伙) 32204 | 代理人: | 徐莹 |
地址: | 212400 江苏省镇江市*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | 本发明公开了一种葡萄夏黑的基因转化方法,包括在组培苗叶片、叶柄、茎段上取材,侵染,共培养,筛选培养,生根培养。本发明从取材上进行优化,对外植体叶片的生长部位、生长的时间有明确的规定,避免取材的盲目性造成工作效率低;同时,选取除叶片以外的外植体,分别是葡萄的叶柄和茎段,使用叶柄和茎段能够更好的操作,也能够提高转基因效率,转化效率达到20%以上;解决农杆菌介导法中农杆菌和杂菌的污染问题;解决葡萄转化效率低的问题;解决葡萄转基因从转基因、转基因检测、大田移栽周期长的问题,缩短周期;解决转基因检测工作量大,工作繁重的问题,简化检测方法,加快检测速度。 | ||
搜索关键词: | 一种 葡萄 基因 转化 方法 | ||
【主权项】:
1.一种葡萄夏黑的基因转化方法,其特征在于:包括以下步骤:(1)葡萄夏黑组培苗,在葡萄继代培养基S1上继代35~40天后,在组培苗上取材,包括叶片取材;所述叶片取材包括:取组培苗最顶端的三片叶,将叶片剪下,在无菌条件下,用手术刀在叶片上沿叶脉横切3~5刀,使叶片有伤口,但不切断,易于长愈伤组织;(2)侵染:将材料直接放入悬浮好的菌液中,轻微摇匀,浸染40 分钟,每隔5分钟摇动一次,增加菌液和植物材料的接触面积,侵染完成后倒出菌液,将叶片在无菌滤纸上吸干表面的菌液;(3)共培养:侵染后的叶片接种在葡萄共培养基S2中,25 ℃培养箱中黑暗培养3 天;(4)筛选培养:将共培养后的葡萄叶片,接种在葡萄筛选培养基S3上,使伤口与培养基充分接触,在培养室中25±2 ℃,光照培养,培养20天,葡萄叶片边缘会有白色愈伤组织长出,在体式荧光显微镜下进行观察,有发亮绿光发出的愈伤为抗性愈伤,保留,没有发光的为非抗性愈伤,去除;保留下的抗性愈伤经过40天的培养后,分化出抗性植株;此时再进行荧光检测,在体式荧光显微镜下观察抗性植株,整个抗性植株叶片都发绿光的保留下来,发红光的去除掉;(5)生根培养:抗性植株长到2~3厘米高时,将抗性植株转入葡萄生根筛选培养基S4上生根,获得完整的抗性苗;进行荧光检测,荧光检测中抗性苗的叶片都发亮绿光的确定为转基因植株;其中,所述葡萄继代培养基S1中包括MS培养基2.2g/L、蔗糖30g/L、琼脂 5.5 g/L、IBA0.4mg/L,pH值为5.8,高压灭菌;所述葡萄共培养基S2中包括MS培养基2.2g/L、蔗糖30g/L、琼脂 5.5 g/L、TDZ 1mg/L、ZT 1mg/L,IBA 0.4mg/L,pH值为5.4,高压灭菌,冷却至60℃;所述葡萄筛选培养基S3中包括MS培养基2.2g/L、蔗糖30g/L、琼脂 5.5 g/L、TDZ 1mg/L、ZT 1mg/L ,IBA 0.4mg/L,pH值为5.4,高压灭菌,冷却至60℃加入卡那霉素20mg/L、羧苄青霉素400 mg/L;所述葡萄生根筛选培养基S4中包括MS培养基2.2g/L、蔗糖30g/L、琼脂 5.5 g/L、IBA 0.4mg/L,pH值为5.8,高压灭菌,冷却至60℃加入卡那霉素20mg/L、羧苄青霉素300 mg/L;步骤(2)侵染使用的所述菌液首先需进行菌种活化,包括以下步骤:①将含质粒pK7WG2D农杆菌EHA105在含50 mg/L壮观霉素和50 mg/L利福平的LB固体培养基上划线,28 ℃培养2天;②挑取长好的单菌落2~3个,接种到50 mL LB液体培养基中,28 ℃,在摇床中220 rpm振荡培养至OD600值0.4;③常温下,5000rmp离心8 分钟,去掉上清液,在无菌滤纸上倒扣离心管,尽量将上清液去除,用100mLMS液体重悬菌体,在摇床中振荡培养1小时测定OD600值,控制在0.2~0.3之间。
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