[发明专利]一种葡萄夏黑的基因转化方法

摘要

本发明公开了一种葡萄夏黑的基因转化方法，包括在组培苗叶片、叶柄、茎段上取材，侵染，共培养，筛选培养，生根培养。本发明从取材上进行优化，对外植体叶片的生长部位、生长的时间有明确的规定，避免取材的盲目性造成工作效率低；同时，选取除叶片以外的外植体，分别是葡萄的叶柄和茎段，使用叶柄和茎段能够更好的操作，也能够提高转基因效率，转化效率达到20%以上；解决农杆菌介导法中农杆菌和杂菌的污染问题；解决葡萄转化效率低的问题；解决葡萄转基因从转基因、转基因检测、大田移栽周期长的问题，缩短周期；解决转基因检测工作量大，工作繁重的问题，简化检测方法，加快检测速度。

主权项

1.一种葡萄夏黑的基因转化方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）葡萄夏黑组培苗，在葡萄继代培养基S1上继代35~40天后，在组培苗上取材，包括叶片取材；所述叶片取材包括：取组培苗最顶端的三片叶，将叶片剪下，在无菌条件下，用手术刀在叶片上沿叶脉横切3~5刀，使叶片有伤口，但不切断，易于长愈伤组织；（2）侵染：将材料直接放入悬浮好的菌液中，轻微摇匀，浸染40 分钟，每隔5分钟摇动一次，增加菌液和植物材料的接触面积，侵染完成后倒出菌液，将叶片在无菌滤纸上吸干表面的菌液；（3）共培养：侵染后的叶片接种在葡萄共培养基S2中，25 ℃培养箱中黑暗培养3 天；（4）筛选培养：将共培养后的葡萄叶片，接种在葡萄筛选培养基S3上，使伤口与培养基充分接触，在培养室中25±2 ℃，光照培养，培养20天，葡萄叶片边缘会有白色愈伤组织长出，在体式荧光显微镜下进行观察，有发亮绿光发出的愈伤为抗性愈伤，保留，没有发光的为非抗性愈伤，去除；保留下的抗性愈伤经过40天的培养后，分化出抗性植株；此时再进行荧光检测，在体式荧光显微镜下观察抗性植株，整个抗性植株叶片都发绿光的保留下来，发红光的去除掉；（5）生根培养：抗性植株长到2~3厘米高时，将抗性植株转入葡萄生根筛选培养基S4上生根，获得完整的抗性苗；进行荧光检测，荧光检测中抗性苗的叶片都发亮绿光的确定为转基因植株；其中，所述葡萄继代培养基S1中包括MS培养基2.2g/L、蔗糖30g/L、琼脂 5.5 g/L、IBA0.4mg/L，pH值为5.8，高压灭菌；所述葡萄共培养基S2中包括MS培养基2.2g/L、蔗糖30g/L、琼脂 5.5 g/L、TDZ 1mg/L、ZT 1mg/L，IBA 0.4mg/L，pH值为5.4，高压灭菌，冷却至60℃；所述葡萄筛选培养基S3中包括MS培养基2.2g/L、蔗糖30g/L、琼脂 5.5 g/L、TDZ 1mg/L、ZT 1mg/L ，IBA 0.4mg/L，pH值为5.4，高压灭菌，冷却至60℃加入卡那霉素20mg/L、羧苄青霉素400 mg/L；所述葡萄生根筛选培养基S4中包括MS培养基2.2g/L、蔗糖30g/L、琼脂 5.5 g/L、IBA 0.4mg/L，pH值为5.8，高压灭菌，冷却至60℃加入卡那霉素20mg/L、羧苄青霉素300 mg/L；步骤（2）侵染使用的所述菌液首先需进行菌种活化，包括以下步骤：①将含质粒pK7WG2D农杆菌EHA105在含50 mg/L壮观霉素和50 mg/L利福平的LB固体培养基上划线，28 ℃培养2天；②挑取长好的单菌落2~3个，接种到50 mL LB液体培养基中，28 ℃，在摇床中220 rpm振荡培养至OD600值0.4；③常温下，5000rmp离心8 分钟，去掉上清液，在无菌滤纸上倒扣离心管，尽量将上清液去除，用100mLMS液体重悬菌体，在摇床中振荡培养1小时测定OD600值，控制在0.2～0.3之间。