[发明专利]一种机械法提取鸡胚成肌细胞

摘要

本发明涉及一种生物工程技术领域的细胞提取方法，具体涉及的是一种鸡胚成肌细胞的提取方法，包括如下步骤：第一步，鸡胚灭菌，取胸大肌放入加D‑Hank’s的培养皿中；第二步，修剪肌肉；第三步，用漩涡振荡器振荡悬浮胸大肌；第四步，过滤、离心；第五步，细胞铺板，差速贴壁；第六步，消化获得成肌细胞；第七步，计数、种板。本发明鸡胚成肌细胞提取方法，即用机械振荡法提取鸡胚成肌细胞的技术，保证所提取成肌细胞的纯度、数量、纯度及活力均较其他方法高，为进一步开展家禽肌肉发育调控机理实验打下基础。

主权项

1.一种鸡胚成肌细胞提取方法，其特征是，包括如下步骤：/n第一步，鸡胚灭菌，取胸大肌放入加D-Hank’s的培养皿中；/n第二步，修剪肌肉/n把胸大肌用D-Hank’s洗三遍，然后把D-Hank’s吸掉，剪碎胸大肌，向剪碎后的肌肉里加入2-3ml细胞培养液，将剪碎的胸大肌和细胞培养液一起转移到50ml离心管中，加细胞培养液至10ml；/n第三步，用漩涡振荡器振荡悬浮胸大肌/n用漩涡振荡器振荡悬浮胸大肌，振荡时间为1分钟，静置3分钟后，用移液器收集上清细胞培养液，振荡悬浮次数为4-5次；所述漩涡振荡器功率12W，振荡频率＞2600次/分钟，漩涡振荡器振荡期间振荡1-2秒停止1秒；/n第四步，过滤、离心/n选用100目、400目和600目的滤筛放置于培养皿上进行过滤，将步骤三得到的悬液倒入100目滤筛，去除肉糜和杂质，之后将过滤后的细胞悬液再400目和600目逐级过滤，将过滤后的细胞悬液加入新离心管中，1200转离心7min，用移液器吸掉上清，加入D-Hanks吹打清洗，重悬后再1000转离心4min，吸掉上清，下层沉淀即为细胞；/n第五步，细胞铺板，差速贴壁/n在步骤四所得细胞的离心管中加入5ml细胞培养液，将细胞吹打重悬，将细胞悬液移入直径为10cm的细胞培养皿中，加细胞培养液至10ml后放入培养箱正常培养；40分钟后将细胞培养液及没有贴壁的细胞移入新的细胞培养皿中，如此差速贴壁2次后，隔夜培养；/n第六步，消化获得成肌细胞/n第二天早上，将培养皿中的上层细胞及细胞培养液吸掉，在培养皿表面加入2ml胰酶，1分钟后细胞基本脱落，加入5ml细胞培养液终止消化，将细胞重悬后加入离心管中，1000转离心4分钟，用移液器吸掉上清，下层沉淀即为所需成肌细胞；/n第七步，计数、种板/n在步骤六得到的含有成肌细胞的离心管中加入2ml细胞培养液，将成肌细胞吹打重悬，取10μL细胞悬液加入200ul PCR管中，再加入10μL台盼蓝细胞活性染料，混匀后滴入细胞计数板计数；根据计数结果，将细胞悬液种板，之后加入细胞培养液。/n