[发明专利]一种重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9菌株全细胞催化剂的制备方法

摘要

本发明涉及一种重组解脂亚罗酵母CCFM‑JU277‑9菌株全细胞催化剂的制备方法，该方法包括确定菌体收集时间、确定培养基中油酸浓度、确定培养细胞时间与透性化处理等步骤。本发明方法通过表面活性剂与冻融处理能够增加细胞壁和细胞膜的通透性，减少膜对底物和产物的传质阻力，提高脂肪酸底物和产物进出菌体的速率，从而显著提高重组解脂亚罗酵母全细胞催化生成t10,c12‑CLA的转化效率，非常明显地提高t10,c12‑CLA的产量。

主权项

1.一种重组解脂亚罗酵母CCFM‑JU277‑9菌株全细胞催化剂的制备方法，其特征在于所述制备方法的步骤如下：A、确定菌体收集时间重组解脂亚罗酵母菌株CCFM‑JU277‑9保藏于在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.7284；在温度‑80℃下保存的重组解脂亚罗酵母CCFM‑JU277‑9菌株在YNBD平板培养基中在温度28℃下活化培养4～5天，再在YNBD液体种子培养基中在温度28℃与转速200rpm的条件下摇床种子培养48h；得到的种子培养液接种于分别含有0.0～10.0g/L油酸的YPD液体培养基中进行培养，其中，添加的油酸代替YPD液体培养基中对应浓度的葡萄糖，使各组培养基中的碳元素含量保持一致，同时在不同的培养时间取样，样品经洗涤、干燥，称量并由下式计算得到菌体干重：菌体干重(g/L)＝冻干菌体重量(g)/培养体系体积(L)；以培养时间为横坐标，以菌体干重为纵坐标绘制生长曲线，由所述生长曲线确定收集菌体时间为36h；B、确定培养基中油酸浓度将在含有0.0～10.0g/L油酸的YPD液体培养基中培养36h的重组解脂亚罗酵母CCFM‑JU277‑9菌株培养液，在温度4℃与8000r/min的条件下离心10min，并用灭菌生理盐水洗涤2次，收集酵母菌体，重悬于磷酸盐缓冲液中，使其湿菌体终浓度为100g/L，再添加底物c9,c12‑LA，在转速200rpm、温度28℃与pH6.8的条件下进行催化反应24h，根据t10,c12‑LA产量确定在培养基中的油酸浓度为5.0g/L；C、确定培养细胞时间重组解脂亚罗酵母CCFM‑JU277‑9菌株在含有5g/L油酸的YPD培养基中进行培养，收集培养时间为32、36和40h的菌体，转移至20ml磷酸盐缓冲液中，再添加底物c9,c12‑LA，在温度28℃下进行全细胞催化反应24h，将t10,c12‑CLA产量最高的培养时间确定为培养细胞时间；D、透性化处理在根据步骤A‑C确定的条件下，重组解脂亚罗酵母CCFM‑JU277‑9菌株在含有5g/L油酸的YPD培养基中进行培养36h，收集培养时间为36h的菌体，重组解脂亚罗酵母CCFM‑JU277‑9菌株全细胞转移至20ml磷酸盐缓冲液中，将全细胞湿重调节至100g/L，再加入以体积计0.5％～3.0％吐温80，在摇床中在温度28℃与200rpm的条件下处理2h，于是得到能够提高t10,c12‑CLA产量的重组解脂亚罗酵母CCFM‑JU277‑9全细胞催化剂。