[发明专利]一种速生黄芪和野生黄芪的鉴别方法

摘要

本发明公开一种速生黄芪和野生黄芪的鉴别方法，步骤包括：将黄芪干燥、粉碎；利用PBS缓冲液、80％乙醇、丙酮和淀粉酶依次除去黄芪粉末中水溶性、脂溶性成分和淀粉；将处理过的黄芪粉末依次与EPG、NaCO₃、1M KOH和4M KOH溶液分级混合提取黄芪果胶多糖和半纤维素多糖；对提取的果胶多糖和半纤维素多糖依次进行清洗、除杂和冻干获得多糖粉末；最后经过酸水解、乙酰化和GC‑MS分析，并运用SMICA13和SPSS软件对数据进行处理，获得半纤维素多糖中阿拉伯糖与果胶多糖中阿拉伯糖的摩尔比值，比值>0.5时为速生黄芪，比值<0.5时为野生黄芪。该方法检测灵敏度高，糖组分比例鉴定简单易操作，该发明为黄芪药材资源鉴别提供了依据。

主权项

一种速生黄芪和野生黄芪的鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将干燥的黄芪粉碎成粉末，备用；2)将上述粉末加入PBS缓冲液，置于40～60℃水浴1～2小时，5000转/分钟离心，弃上清；重复2～3次；3)将步骤2)得到的沉淀加入80％乙醇萃取，置于42℃水浴1～2小时，5000转/分钟离心，弃上清；重复上述萃取过程多次至上清无颜色；所得沉淀加入丙酮，5000转/分钟离心，弃上清，沉淀于烘箱45℃烘干；4)将步骤3)得到的沉淀加入pH 7.0、200U/mL的猪胰α‑淀粉酶Tris‑HCl缓冲液，37℃震荡过夜；5000转/分钟离心，弃上清；沉淀用去离子水清洗，5000转/分钟离心，弃上清收集沉淀；重复清洗至少3次后，烘干备用；5)将步骤4)得到的沉淀过百目筛后，加入3U/mL的果胶酶反应液，24℃摇床200rpm 24小时，5000转/分钟离心，收集上清，重复提取2～3次；沉淀用去离子水清洗2～3次，5000转/分钟离心，收集上清并合并，总上清过玻璃纤维滤膜得到果胶粗多糖A，冻存；所得沉淀加入50mM Na₂CO₃+5mM EGTA的混合溶液，24℃摇床200rpm 12小时，5000转/分钟离心，收集上清，重复2～3次；沉淀用去离子水清洗2～3次，5000转/分钟离心，收集上清并合并，总上清过玻璃纤维滤膜得到果胶粗多糖B，冻存；6)将步骤5)得到的沉淀，加入1MKOH+1％NaBH₄混合溶液，24℃摇床200rpm 12小时，5000转/分钟离心，收集上清，重复2～3次；沉淀用去离子水清洗2～3次，5000转/分钟离心，收集上清并合并，总上清过玻璃纤维滤膜得到半纤维素粗多糖C，冻存；所得沉淀加入4MKOH+1％NaBH₄混合溶液，24℃摇床200rpm 12小时，5000转/分钟离心，收集上清，重复2～3次；沉淀用去离子水清洗2～3次，5000转/分钟离心，收集上清并合并，总上清过玻璃纤维滤膜得到半纤维素粗多糖D，4℃保存；7)将步骤5)、6)获得的果胶粗多糖B、半纤维素粗多糖C和D上清液分别用冰醋酸中和至pH5.0，将果胶粗多糖A在70℃保持30min使酶失活；将中和及失活后的溶液分别转移至透析袋透析，浓缩，除蛋白，冷冻干燥；得到黄芪果胶多糖A、B和半纤维素多糖C、D；8)分别称取黄芪果胶多糖A、B和半纤维素多糖C、D各10mg，各自加入2mL浓度为2mol/L三氟乙酸溶液，121℃水解90分钟；取200μL水解液低温冻干，加入0.5mL 10mg/mL硼氢化钠的二甲亚砜溶液室温振荡反应2小时；逐滴加入4mol/L乙酸中和至中性；加入0.1mL甲醇，氮气吹干；加入200μL乙酸酐和50μL 1‑甲基咪唑进行乙酰化反应，15分钟后加水停止反应；加入2mL二氯甲烷萃取后，用氮气适当吹浓后，取有机相1μL进GC/MS分析；9)获得GC/MS图谱，结合内标法求算果胶多糖和半纤维素多糖中阿拉伯糖的含量，并求算半纤维素多糖中阿拉伯糖与果胶多糖中阿拉伯糖的摩尔比值，比值>0.5时为速生黄芪，比值<0.5时为野生黄芪。