[发明专利]一种制备鱼类肠壁黏液菌群DNA的方法

摘要

本发明公开了制备鱼类肠壁黏液菌群DNA的方法，该方法包括：利用化学方法与物理方法的共同作用，使黏液与肠壁分开，使黏液中的细胞充分分散到溶液中；利用过滤法将细菌细胞与宿主细胞分离开，获得肠壁黏液菌群混合液；利用裂解液对肠壁黏液菌群进行裂解，获得含有核酸的裂解液；进一步利用RNase A、蛋白酶K等对含有核酸的裂解液进行提纯，获得鱼类肠壁黏液菌群DNA。此方法操作简便，制备的DNA收率高、纯度高、质量好，DNA信息更加全面、完整、准确。

主权项

1.一种制备鱼类肠壁黏液菌群DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）在无菌条件下，用75%酒精清洗鱼体表面，用无菌剪刀和镊子解剖取出肠道，所取鱼肠道用75%酒精消毒表面，再用PBS 缓冲液清洗肠道表面3~5遍；（2）用无菌剪刀将所述肠道纵向剪开，使用PBS 缓冲液冲洗肠道内部8~12次，去除肠道中的粪便污水等内容物，得到去除内容物的肠道；（3）用无菌剪刀将所述去除内容物的肠道剪成小段，放入50 mL离心管中，加入PBS‑ET 缓冲液、蓖麻油、石英砂，置于涡旋振荡仪上振荡，得到含肠混合物；（4）将所述含肠混合物依次通过100 µm、20 µm、11 µm、8 µm的滤膜分级过滤，所得滤液即为获得肠壁黏液菌群混合液；（5）直接向所述肠壁黏液菌群混合液中加入裂解液进行细胞裂解；得到含核酸的裂解液；（6）向所述含核酸的裂解液中加入10 µL 10 mg/mL RNase A，37℃水浴处理30~60 min，得到含DNA的处理液1；（7）向所述含DNA的处理液1中加入50 µL 20mg/mL蛋白酶K，70℃水浴处理30~60 min，8000~10000 rpm离心15~30 min，离心取上清，得到含DNA的处理液2；（8）向所述含DNA的处理液2中加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇混合液，苯酚:氯仿:异戊醇体积比=25:24:1，充分混匀后，8000~10000 rpm离心15~30 min，离心取上层液，得到含DNA的处理液3；（9）向所述含DNA的处理液3中加入等体积的氯仿:异戊醇混合液，氯仿:异戊醇体积比=24:1，充分混匀后，8000~10000 rpm离心15~30 min，离心取上层液，得到含DNA的处理液4；（10）向所述含DNA的处理液4中加入0.6~0.8倍体积异戊醇混合均匀，‑20℃放置1~2 h后，8000~10000 rpm离心15~30 min后，弃上清得到的沉淀用70%酒精洗涤2~3遍，即获得所述鱼类肠壁黏液菌群DNA；所述步骤1)、2）的PBS 缓冲液中含有137 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、10 mmol/L Na2HPO4、2 mmol/L KH2PO4；所述步骤3)用无菌剪刀将所述去除内容物的肠道剪成小段，取6~10 g肠小段放入50 mL离心管中，加入10~15 mL PBS‑ET 缓冲液、1~2 mL蓖麻油、6~10 g石英砂，置于涡旋振荡仪上，3000 rmp振荡2~3 min后，1500 rmp振荡5~7min，得到含肠混合物；并且所述PBS‑ET 缓冲液的成分为0.5wt.% Twen‑20、10 mmol/L EDTA、137 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、10 mmol/L Na2HPO4、2 mmol/L KH2PO4，所述石英砂为40目~100目的石英砂；所述步骤5)中裂解液，其成分为6wt.% SDS、200 mmol/L NaCl、200 mmol/L Tris、20 mmol/L EDTA，并且所述加入裂解液的体积为所述肠壁黏液菌群混合液体积的5~7倍，裂解温度为70℃，裂解时间为30~60 min，得到含核酸的裂解液。