[发明专利]一种脱毒白背三七组织细胞的培养方法

摘要

本发明涉及农业生物技术中植物细胞培养的方法，尤其涉及一种脱毒白背三七组织细胞的培养方法，包括以下处理步骤：1)、白背三七外植体初代愈伤组织细胞团诱导，2)、愈伤细胞团的继代筛选，3)、白背三七悬浮细胞的制备，4)、白背三七单细胞的大量克隆；5)、单细胞定向诱导形成组织细胞团。本发明通过液体组培的方式及进行培养条件和营养因子的调控，来脱除白背三七中的吡咯里西啶生物碱，同时又提高了其他活性成份的含量，如黄酮、多糖、萜烯等化合物。

主权项

1.一种脱毒白背三七组织细胞的培养方法，其特征在于，包括以下处理步骤：1)、白背三七外植体初代愈伤组织细胞团诱导：采集白背三七的外植体，对外植体进行表面消毒：将外植体切成合适大小后接入B1培养基中25℃，暗培养10～20天，即可获得初代愈伤组织细胞团；所述B1培养基包括以下用量的各原料混合而成：1/2MS、2,4-D：0～2mg/L、6-BA：0～2mg/L、玉米素：0～2mg/L、琼脂粉：7g/L、pH:5～7,混合后的物料按每瓶50～100mL配液装入300~650mL透气玻璃瓶中，121℃高温高压蒸汽灭菌30分钟，冷却备用；所述1/2MS培养基包括以下用量的各原料混合组成：KNO3:950mg/L、NH4NO3：825 mg/L、MgSO4·7H2O：185mg/L、KH2PO4:85 mg/L、CaCl2·2H2O:220mg/L、MnSO4·4H2O:22.3 mg/L、ZnSO4·7H2O：8.6mg/L、H3BO3：6.2 mg/L、KI：0.83 mg/L、Na2MoO4·7H2O：0.25 mg/L、CuSO4.5H2O：0.025 mg/L、Na2-EDTA：37.3 mg/L、FeSO4.4H2O：27.8 mg/L、甘氨酸：2.0 mg/L、盐酸吡哆醇：0.5 mg/L、盐酸硫铵素：0.1 mg/L、烟酸：1 mg/L、肌酸：100 mg/L;2)、愈伤细胞团的继代筛选:选取长势较好、无明显褐化的初代愈伤细胞团转入B2培养基中，25℃，暗培养，每隔10～20天为一个继代周期，经过3～6个的继代筛选培养，即可获得疏松、娕黄色的愈伤细胞团；所述B2培养基包括以下用量的各原料混合而成： 1/2MS,NAA：0～2mg/L，6-BA ：0～2mg/L，玉米素：0～2mg/L，琼脂粉：7g/L，pH：5～7，混合后的物料，按每瓶50～100mL配液装入300～650mL透气玻璃瓶中，121℃高温高压蒸汽灭菌30分钟，冷却备用；3)、白背三七悬浮细胞的制备:将经过继代筛选获得的愈伤细胞团转入B3培养基中，25℃，弱光培养，每隔15～30天为一个继代周期，经过3～6个的继代筛选培养，即可获得悬浮单细胞或小细胞团；所述B3培养基包括以下用量的各原料混合而成：1/2MS，NAA:0～2mg/L，6-BA:0～2mg/L，果胶酶:20～50mg/L，pH:5～7，混合后的物料混匀后，装入1000～5000mL的通气悬浮培养瓶中，装液量50～70%，121℃高温高压蒸汽灭菌30分钟，冷却备用；4)、白背三七单细胞的大量克隆:将白背三七的悬浮细胞以105～106个/mL的浓度转入B3培养基中，25℃，弱光培养10～20天，可获得大量的细胞种源；5)、单细胞定向诱导形成组织细胞团:将优质种源细胞以105～106个/mL的浓度转入装有B4培养基大型光照通气悬浮培养罐中，25℃，1000～3000lux光照培养20～30天，最终即可获得脱毒的白背三七组织细胞团, 所述B4培养基包括以下用量的各原料混合而成：1/2MS，2,4-D：0～2mg/L，6-BA：0～2mg/L，蛋白胨粉：50～200mg/L，pH：5～7，原料均匀混合后装入10～500L的通气悬浮培养罐瓶中，装液量50～70%，121℃高温高压蒸汽灭菌30分钟，冷却备用。