[发明专利]一种多DNA片段载体的构建方法及其应用

摘要

本发明公开了一个组装载体和多DNA片段或多基因表达单元载体的构建方法。所述组装载体为一个基于切刻内切酶识别位点的组装载体，既可以用作接受载体也可以用作供给载体，所述方法包括利用切刻内切酶酶切和连接反应将作为供给载体的组装载体中目的DNA片段组装到作为接受载体的组装载体中构建成多DNA片段载体。本文中的组装载体和方法可用于构建任意的包含多DNA片段遗传工程载体，并在不同的细胞、组织或者器官中表达。

主权项

1.一种组装载体，包含复制起始位点、抗性筛选标记基因，还包含一个nicking box循环组装单元，所述nicking box循环组装单元包含沿DNA 5’→3’方向排列的A、B、C、D四个nicking box，一个高效的DNA克隆位点MCS和三个间隔序列，其中，所述A、B、C和D四个nicking box，均由一对同种切刻内切酶的识别位点和位于所述同种切刻内切酶识别位点之间的间隔碱基组成，且所述同种切刻内切酶的两个切刻位点分别位于双链DNA的上下两条链上；所述A和D nicking box各含有切刻内切酶M酶切位点，所述B和C nicking box各含有切刻内切酶N的酶切位点，所述切刻内切酶M和N不同，但为同类切刻内切酶；所述A nicking box产生的粘性末端与所述B nicking box产生的粘性末端序列完全相同，所述C nicking box产生的粘性末端与所述D nicking box产生的粘性末端序列完全相同，且所述A和B nicking box中的粘性末端与所述C和D nicking box中粘性末端不互补；所述高效DNA克隆位点MCS包含限制性内切酶识别位点,位于A和B nicking box之间；所述三个间隔序列分别位于C和D nicking box之间，B和C nicking box之间，与D nicking box之后。