[发明专利]一种快速鉴定鹅细小病毒与樱桃谷鸭源细小病毒的双重PCR方法

摘要

本发明涉及一种快速鉴定鹅细小病毒与樱桃谷鸭源细小病毒的双重PCR方法，主要是设计并筛选了新的特异性引物，优化了反应过程中的各种参数，利用本组引物建立的针对鹅细小病与樱桃谷鸭源细小病毒的双重PCR方法特异性强、敏感性高，可以快速准确地进行鹅细小病毒和新型樱桃谷鸭源细小病毒的鉴定。本发明建立的双重PCR方法重复性好、可信度高，同时又价格低廉、操作相对简单，适用于大规模流行病学调查。本发明经过1500份样品的检测证明具有很好的可信度，并且只需要普通PCR仪即可进行，由于引物合成价格已经非常便宜，本专利反应成本与普通PCR反应相差无几，实验操作也相对简单，适用于目前我国的畜牧业生产实际。

主权项

1.一种用于非诊疗目的的快速鉴定鹅细小病毒与樱桃谷鸭源细小病毒的双重PCR方法，其特征在于步骤如下：A、常规方法提取待测鸭各个脏器组织DNA作为模板，进行PCR反应；反应体系为：1 μL组织DNA、含有50 mM KCl, 10 mM Tris‑HCl，pH值为8.3的1× PCR buffer、1.5 mM MgCl2、0.15 mM dNTPs、1 U Taq DNA Polymerase、引物SEQ 1、SEQ 2各1 μL ，引物SEQ3 0.7 μL、SEQ4 0.5μL；加水补齐至25μL；PCR扩增程序为：95℃ 7min；95℃ 45s，50℃ 45s，72℃ 55 s，共33个循环；最后72℃延伸10min；B、对步骤A得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测：如果从样品中扩增出了779bp和147bp的产物或者单独扩增出147bp的特异性条带，则该样品为樱桃谷鸭源细小病毒阳性，鹅细小病毒阴性；如果从样品中扩增出了779bp和580bp的产物或者单独扩增出580bp的特异性条带，则该样品为鹅细小病毒阳性，樱桃谷鸭源细小病毒阴性；如果同时扩增出了779bp、580bp和147bp的产物，则该样品为鹅细小病毒和樱桃谷鸭源细小病毒同时存在；如果未扩增出779bp、147bp和580bp的产物，则该样品不含有鹅细小病毒和樱桃谷鸭源细小病毒；所述的特异性引物如下：SEQ 1：5’‑ AGACTTATCAACAACCAT(C)T ‑3’，SEQ 2：5’‑ TCACTTATTCCTGCTGTAG ‑3’，SEQ 3：5’‑ CCGTTCCCGTCGGATGTC(G) ‑3’，SEQ 4：5’‑ CATCATCCGTAAAAACTTGG ‑3’。