[发明专利]基于流式细胞检测技术的破囊壶菌快速测定方法

摘要

本发明公开了一种基于流式细胞检测技术的破囊壶菌快速测定方法，包括如下步骤：(1)取样和样品前处理：将样品用除菌液稀释或固定，待测样品用吖啶黄溶液避光染色；同时，配制荧光微球悬液作为内参；(2)流式细胞检测：使用配备488nm激光器的流式细胞仪测试样品；(3)内参荧光微球计数：用纯水稀释荧光微球悬液，涡旋振荡混匀后过滤到黑色聚碳酸酯膜上，制作玻片，用荧光显微镜对内参荧光微球进行绝对计数；(4)破囊壶菌丰度计算：使用FlowJo或CellQuest软件分析流式数据，主要包括破囊壶菌的圈门和计数。本发明的方法具有较高的自动化和流程化程度，可以减少人为操作带来的误差，因而拥有更好的精密度和稳定性。

主权项

1.一种基于流式细胞检测技术的破囊壶菌快速测定方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取样和样品前处理：将样品用除菌液稀释或固定，待测样品用吖啶黄溶液避光染色；同时，配制荧光微球悬液作为内参；(2)流式细胞检测：使用配备488nm激光器的流式细胞仪测试样品；(3)内参荧光微球计数：用纯水稀释荧光微球悬液，涡旋振荡混匀后过滤到黑色聚碳酸酯膜上，制作玻片，用荧光显微镜对内参荧光微球进行绝对计数；(4)破囊壶菌丰度计算：使用FlowJo或CellQuest软件分析流式数据，主要包括破囊壶菌的圈门和计数；所述样品为天然海水，在综合考察和参考人工培养的破囊壶菌的流式信号特点的基础上，按照以下步骤圈门：第一步，在FL3‑FSC图中，根据较高的叶绿素荧光信号，圈出光合真核微生物；第二步，在FL1‑SSC图中，根据较高的侧向散射信号和较低的绿色荧光信号，圈出碎屑颗粒；第三步，在FL3‑FL1图中，圈出内参荧光微球；第四步，在移除光合真核微生物和碎屑颗粒后的FL1‑FSC图中，根据内参荧光微球及参考菌株的FSC信号范围，圈出大于2μm的异养原生生物；第五步，在第四步已圈出的大于2μm的异养原生生物的基础上，参考可培养破囊壶菌在FL3‑FL1图中的荧光信号特点，将海水样品中的破囊壶菌与其它异养微型浮游原生生物相区分，圈出破囊壶菌。