[发明专利]一种结合1H-NMR和CRAFT技术定性和定量分析天麻中有效成分的方法

摘要

本发明提供了一种结合1H‑NMR和CRAFT技术定性和定量分析天麻中有效成分的方法。该方法将核磁共振与CRAFT技术结合，为核磁共振混合物分析的新方法。本发明样品的制备简单，扫描时间短，能够较为全面地反映天麻特征化学成分的信息，对所有组分的灵敏度一致，无偏向性，还可以提供特征化合物的化学位移、偶合常数以及峰面积等大量重要的结构信息；CRAFT对天麻中天麻素和对羟基苯甲醇定性和定量分析快速简便，重现性好，精密度高。该方法是核磁共振技术和CRAFT技术的有机结合，快速有效的实现了对天麻中天麻素和对羟基苯甲醇定性和定量分析，且不需要对照品和对照试验，消除了由于相位校正，基线校正的积分误差。

主权项

1. 一种结合1H‑NMR和CRAFT技术定性和定量分析天麻中有效成分的方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤一：供试品、对照品和内标溶液的制备取天麻，按常规方法制成总提物浸膏；准确称取总提物浸膏，用DMSO‑d6溶解于核磁管中，得供试品溶液；称取天麻素TMS和对羟基苯甲醇O‑TM标准品，以DMSO‑d6溶解，制成TMS标准品溶液和O‑ TM标准品溶液；准确称取间苯三酚标准品，以DMSO‑d6溶解，制得间苯三酚标准溶液，以作为定量核磁共振的内标；步骤二：1HNMR指纹图谱的测定及优化采用Varian 400MHz核磁共振波谱仪，测试天麻供试品溶液的1HNMR指纹图谱，得天麻1HNMR谱图；运用CPMG技术优化图谱；步骤三：CRAFT定性分析导入天麻CPMGT2谱图，进入CRAFT分析软件，对天麻素和对羟基苯甲醇特征峰进行下采样，执行CRAFT计算，导入天麻素和对羟基苯甲醇指纹表，提取频率振幅表，所得频率F、振幅 A和CRAFT模型用于定性分析，特征峰频率F所对应的振幅A之比等于其质子数之比，从而鉴定天麻中天麻素和对羟基苯甲醇；步骤四：CRAFT定量分析线性关系考察：制备5个不同浓度比的天麻提取物和内标物间苯三酚混合待测样品，振荡摇匀后测定其CPMGT2谱图，对每个样品中天麻素、对羟基苯甲醇和间苯三酚的定量峰进行5次CRAFT计算提取其振幅值，求其平均值，分别以天麻素、对羟基苯甲醇与间苯三酚定量峰的振幅比对天麻总提取物与间苯三酚的质量比进行线性回归；精密度考察和定量分析：选取同一批天麻样品，制备5份天麻总提物和内标物间苯三酚的混合样品，测定其CPMGT2谱图，进行精密度的测定，对样品中天麻素、对羟基苯甲醇和间苯三酚的定量峰进行5次CRAFT分析提取其振幅A值，求其平均值，计算天麻中天麻素和对羟基苯甲醇的含量；所述步骤一中，供试品溶液这样制备：取天麻，蒸50～60min蒸透后切成薄片，烘干，粉碎过三号筛，取天麻粉末，加入25倍量50％稀乙醇超声30min，超声条件：150w，40KHz；静置，用水系微孔滤膜经注射器挤压过滤，取滤液回收溶剂，在50℃烘箱中挥干，得总提物浸膏；准确称取总提物浸膏，以0.03倍量的DMSO‑d6溶解于核磁管中，得供试品溶液；所述步骤一中，对照品溶液这样制备：称取天麻素TMS和对羟基苯甲醇O‑TM标准品，以DMSO‑d6溶解，制成含量为5.15mg/mL TMS标准品溶液和2.65mg/mL O‑TM标准品溶液；所述步骤一中，内标溶液这样制备：准确称取间苯三酚标准品，以DMSO‑d6溶解，制得含量为10.4mg/mL的间苯三酚标准溶液，以作为定量核磁共振的内标；所述步骤二为：采用Varian 400MHz核磁共振波谱仪，测试天麻供试品溶液的1HNMR指纹图谱，测定温度为25.0℃，增益为20，延迟时间10s，采样次数为4次，线性加宽因子为1Hz，得天麻1HNMR谱图；运用CPMG技术优化图谱，测定温度为25.0℃，增益为20，延迟时间10s，采样次数为4次，线性加宽因子为1Hz，自旋回波循环时间tau为0.001s，自旋回波循环总时间bigtau依次为0.001s、0.01、0.025s、0.03s、0.05s、0.1s；当bigtau＝0.1s时，大分子信号滤干净了而小分子信号仍在，从而优化了谱图；所述步骤三为：导入天麻CPMGT2谱图，进入CRAFT分析软件，对天麻素和对羟基苯甲醇特征峰进行下采样，下采样因素为32，线展宽为1，CRAFT最大线宽为20，执行CRAFT计算，导入天麻素和对羟基苯甲醇指纹表，提取频率振幅表，所得频率F、振幅A和CRAFT模型用于定性分析，特征峰频率F所对应的振幅A之比等于其质子数之比，从而鉴定天麻中天麻素和对羟基苯甲醇。