[发明专利]一种小麦完整叶绿体的制备方法

摘要

本发明属于生物技术领域，涉及植物完整细胞器分离纯化技术领域，具体涉及一种简便快捷的小麦完整叶绿体的制备方法。步骤如下：（1）制备Percoll梯度；（2）小麦样品的预处理；（3）小麦样品的密度梯度离心；（4）完整叶绿体的提取。本发明以Percoll为介质进行梯度离心，不仅可以区分小麦完整及破损叶绿体，而且制备时间短，程序简便，获得充足的完整的叶绿体，进行定量测定后，可以精确的运用于叶绿体功能、膜蛋白、基质蛋白及叶绿体DNA的提取及各种后续研究。

主权项

1.一种小麦完整叶绿体的制备方法，其特征在于：步骤如下：（1）制备 Percoll梯度；（2）小麦样品的预处理；（3）小麦样品的密度梯度离心；（4）完整叶绿体的提取；所述步骤（1）中Percoll梯度的制备方法为：称取异抗坏血酸和谷胱甘肽各10 mg，置于离心管中，加入15mL 2×GB缓冲液，加入15 mL Percoll混匀；于4℃、37,000g 离心30min，离心完成后，小心取出离心管，置于冰上备用；所述步骤（2）的操作为：取小麦新鲜叶片20‑30克，剪碎后，于4℃条件下粉碎，加入150‑180mL的1×GB缓冲液浸没小麦组织，以10,000‑12,000rpm的速度粉碎1秒，接着间隔1秒的模式处理样品，重复该模式6‑7次，粉碎样品；然后以4,000‑6,000rpm的速度，连续粉碎4‑6秒，制得组织匀浆；将上述组织匀浆倒入医用纱布中，挤压过滤，滤液挤入预冷的50mL离心管中，于4℃、3000g条件下，离心5min；弃上清，向沉淀中加入700μL的1×GB缓冲液，用软毛笔将沉淀悬浮，合并到1个离心管中，制得叶绿体溶液；所述步骤（3）的操作为：用胶头滴管将步骤（2）中的叶绿体溶液沿管壁缓慢加到步骤（1）制备的Percoll梯度上面；于4℃、8000g条件下，离心10min，小心取出离心管，得到两个绿色条带，下面的是完整的叶绿体；所述步骤（4）的操作为：吸取步骤（3）得到的完整叶绿体条带，放入50mL离心管中，加满1×IB提取缓冲液，4℃、1500g条件下，离心5min；弃上清，用1×IB提取缓冲液悬浮沉淀，重复洗一次叶绿体，用400 μL的1×IB提取缓冲液悬浮沉淀，转移到1.5mL的EP管中，置于冰上，于黑暗中保存；所述1×GB缓冲液的配方为：0.1M K‑Hepes、0.66M山梨醇、2mM MgCl₂、2mM MnCl₂、4mM Na₂EDTA和0.2% BSA，pH调至7.3，制得2×GB缓冲液的贮液，于4℃保存，稀释一倍即得1×GB缓冲液；所述1×IB 提取缓冲液的配方为：0.1M K‑tricine和0.66M山梨醇，pH调至8.0，制得2×IB提取缓冲液的贮液，稀释一倍即得1×IB提取缓冲液；所述药品和溶液均于4℃下保存。