[发明专利]一种超耐受金属螯合亲和填料的制备和应用

摘要

本发明涉及纯化填料的制备技术领域，特别是一种超耐受金属螯合亲和填料的制备和应用，该制备方法包括配体偶联和金属离子螯合步骤，所得金属螯合亲和填料(IMAC)，螯合有非常牢固的金属离子，可应用于带有组氨酸标签(His‑tag)蛋白的捕获和纯化；该类型亲和填料耐受性能优异，可在含有EDTA及DTT的情况下进行目的蛋白高效纯化，避免繁琐的纯化前切换缓冲液的处理；使用过程中金属离子脱落少，无需剥离金属离子，即可进行1M氢氧化钠在位清洗，可有效简化填料的再生处理步骤，具有强组分兼容性，适用于广泛底物及盐浓度的缓冲条件，具有载量高，纯化纯度高，使用寿命长，使用成本低的优点，适宜进一步推广应用。

主权项

1.一种超耐受金属螯合亲和填料的制备方法，其特征是：该填料制备方法为：将偶联配体的填料加入金属离子溶液10‑30℃反应2‑12h得金属螯合亲和填料；所述偶联配体结构式为如下Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ中的一种，其中，A为N、P或S中的一种，B为羟基、伯胺、仲胺、羧基、巯基、环氧基或烯丙基中的一种，M为羟基、伯胺、仲胺、羧基或磷酸根中的一种，n为1‑3；所述偶联配体的填料的制备方法为：采用氨基反应法将微球加入环氧氯丙烷、NaOH溶液，DMSO于30‑45℃振荡活化1‑2h，活化完毕后将微球清洗干净至无环氧氯丙烷；加入配体，在pH为9‑11，30‑50℃条件下反应24h得偶联配体的填料；其中NaOH溶液为1‑3M,环氧氯丙烷与微球加入量比例为(0.1‑0.5)mg：1mL或(0.1‑0.5)mg：1g，偶联配体与微球加入量比例为(10‑100)mg：1mL或(10‑100)mg：1g；或者，所述偶联配体的填料的制备方法为采用羧基反应法，首先将微球加入环氧氯丙烷、NaOH溶液，DMSO于30‑45℃振荡活化1‑2h，活化完毕后将微球清洗干净至无环氧氯丙烷；加入胺在pH为9‑11，30‑50℃条件下反应24h得氨基活化填料；其中，NaOH溶液为1‑3M,环氧氯丙烷与微球加入量比例为(0.1‑0.5)mg：1mL或(0.1‑0.5)mg：1g，胺与微球加入量比例为(0.01‑0.1)mg：1mL或(0.01‑0.1)mg：1g；然后将偶联配体溶于0.1M MES，加入上述氨基活化填料，在pH为5.0时加入0.1M EDC，20‑30℃反应1h后，在pH为5.0时继续反应24h得偶联配体的填料；其中，偶联配体与微球加入量比例为(10‑100)mg：1mL或(10‑100)mg：1g；所述金属离子为Fe2+、Ni2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+、Ti4+或Co2+中的一种。