[发明专利]携带PAP抗原基因的重组腺相关病毒载体及构建方法与应用

摘要

本发明公开了一种携带前列腺酸性磷酸酶(PAP)抗原基因的重组腺相关病毒载体(rAAV)及其构建方法与其应用。该rAAV载体是将腺相关病毒载体中的腺相关病毒的结构基因替换为PAP抗原基因得到。本发明的rAAV的病毒载体可将其携带的PAP抗原基因输送入单核细胞‑树突状细胞系中，被用于刺激免疫系统的效应细胞。实验证明，被本发明的rAAV的病毒载体感染的DC所诱导的CTL在体外或患者体内可有效地抑制PAP抗原阳性的恶性肿瘤细胞的生长或者杀灭肿瘤细胞。本发明的重组腺相关病毒载体或其相关产品可被用于制备治疗抗PAP抗原阳性的前列腺癌的药物。

主权项

1.一种携带前列腺酸性磷酸酶PAP抗原基因的重组腺相关病毒载体，其特征在于：将腺相关病毒载体中的腺相关病毒的结构基因替换为PAP抗原基因得到的重组腺相关病毒载体；所述重组腺相关病毒载体的构建方法包括以下步骤：1)改建AAV 2型pBR322质粒：使用限制性内切酶Bst98 I 和Hpa I将AAV 2型pBR322质粒中的AAV 2型腺相关病毒中的结构基因切除，然后将含有限制性内切酶EcoR I和EcoR V酶切位点的核苷酸序列CGAATTCATGCGATATCGTT 插入质粒中，保留两端的TR序列或在两端的TR序列的第75位核苷酸序列处均插入由9 个核苷酸组成的片段CTGCGCTGG；2)将启动子插入步骤1)得到的改建的AAV 2型pBR322 质粒中，构建携带有启动子的AAV 2型pBR322质粒；所述启动子为p5启动子或者下述三种启动子中的一种：巨噬细胞病毒启动子、β‑肌动蛋白启动子或SV40早期启动子；3）获取PAP cDNA，包括以下步骤：31）从前列腺癌组织中提取PAP的总mRNA，由总mRNA进行逆转录反应，合成总cDNA；32）以所述总cDNA为模板，在引物1：CATGAGAGCTGCACCCCTCC和引物2：CTAATCTGTACTGTCCTCAGT的引导下进行PCR扩增，得到所述PAP cDNA, 其核苷酸序列为：CATGAGAGCTGCTCCCCTCCTCCTGGCCAGGGCAGCAAGCTTAGCCTTGGCTTCTTGTTTCTGCTTTTTTTGCTGGCTAGACCGAAGTGTACTAGCCAAGGAGTTGAAGTTTGTGACTTTGGTGTTTCGGCATGGAGACCGAAGTCCCATTGACACCTTTCCCACTGACCCCATAAAGGAATCCTCATGGCCACAAGGATTTGGCCAACTCACCCAGCTGGGCATGGAGCAGCATTATGAACTTGGAGAGTATATAAGAAAGAGATATAGAAAATTCTTGAATGACTCCTATAAACATGAACAGGTTAATATTCGAAGCACAGACGTTGACCGGACTTTGATGAGTCGTATGACAAACCTGGCAGCCCTGTTTCCCCCAGAAGGTGTCAGCATCTGGAATCCTATCCTACTCTGGCAGCCCATCCCGGTGCACACAGTTCCTCTTTCTGAAGATCAGTTGCTATACCTGCCTTTCAGGAACTGCCCTCGTTTTCAAGAACTTGAGAGTGAGACTTTGAAATCAGAGGAATTCCAGAAGAGGCTGCACCCTTATAAGGATTTTATAGCTACCTTGGGAAAACTTTCAGGATTACATGGCCAGGACCTTTTTGGAATTTGGAGTAAAGTCTACGACCCTTTATATTCTGAGAGTGTTCACAATTTCACTTTACCCTCCTGGGCCACTGAGGACACCATGACTAAGTTGAGAGAATTGTCAGAATTGTCCCTCCTGTCCCTCTATGGAATTCACAAGCAGAAAGAGAAATCTAGGCTCCAAGGGGGTGTCCTGGTCAATGAAATCCTCAATCACATGAAGAGAGCAACTCAGATACCAAGCTACAAAAAACTTATCATGTATTCTGCGCATGACACTACTGTGACTGGCCTACAGATGGCGCTAGATGTTTACAACGGACTCCTTCCTCCCTATGCTTCTTGCCACTTGACGGAATTGTACTTTGAGAAGGGGGAGTACTTTGTGGAGATGTACTACCGGAATGAGACGCAGCACGAGCCGTATCCCCTCATGCTACCTGGCTGCAGCCCCAGCTGTCCTCTGGAGAGGTTTGCTGAGCTGGTTGGCCCTGTGATCCCTCAAGACTGGTCCACGGAGGTTATGACCACAAACAGCCATCAAGGTACTGAGGACAGTACAGTTTAG；4）将已构建的携带有启动子的AAV 2型pBR322质粒和步骤3）得到的PAP cDNA分别用限制性内切酶XbaI和XhoI进行酶切反应，然后进行DNA连接反应，得到携带有启动子和PAP cDNA的重组腺相关病毒载体。