[发明专利]用于检测微量组织中KRAS基因突变的引物组合及其应用

摘要

本发明公开了一种用于检测微量组织中KRAS基因突变的引物组合，其包括预扩增引物组、用于检测2号外显子突变的引物组、用于检测3号外显子突变的引物组；该方法旨在将微量的DNA通过预扩增得到较高浓度的DNA模板，结合直接测序法检测样本中KRAS基因的突变情况；将该引物组合应用于制备检测KRAS基因突变的检测试剂中，可检测样本的DNA浓度低至100pg，且可以同时检测KRAS基因第2和3号外显子的所有突变，本发明提供的检测方法灵敏度高，特异性强，成本低，适用于临床肿瘤患者KRAS基因突变的检测，具有很好的临床应用价值。

主权项

1.用于检测微量组织中KRAS基因突变的引物组合，其特征在于:由如SEQ ID NO:1‑ SEQ ID NO:18所示的预扩增引物组、如SEQ ID NO:19‑ SEQ ID NO:20所示的用于检测2号外显子突变的引物组、如SEQ ID NO:21‑ SEQ ID NO:22所示的用于检测3号外显子突变的引物组组成；用于检测KRAS基因突变的引物组合的检测使用方法，具体步骤如下：（1）引物稀释将primer1‑prime18分别稀释后混匀制得Primer Mix，其中primer1‑primer16引物的终浓度为0.05‑0.1μM，primer17‑primer18引物的终浓度为1‑3μM；primer19‑primer22引物稀释至5‑10μM；（2）预扩增在扩增管中加入1μL的10×反应缓冲液、2.5μL的Primer Mix、100‑1000pg微量DNA模板、用去离子水补足至8.8μL；混匀，98℃预变性5‑10min，然后置于冰上10‑20min；再加入0.5μL dNTP 10mM each、0.2μL 100×BSA以及0.5μL phi29 DNA聚合酶，30‑35℃扩增过夜，65℃加热10‑20min使酶失活；（3）使用PCR纯化试剂盒纯化上述预扩增产物；（4）KRAS基因突变检测针对KRAS基因的2,3号外显子突变，分别采用如SEQ ID NO:19‑ SEQ ID NO:20所示的引物组检测2号外显子突变；如SEQ ID NO:21‑ SEQ ID NO:22所示的引物组检测3号外显子突变；配置PCR反应总体系为25μL：其中Pfu Mix混合液12.5μL、5‑10μM正向引物0.5‑1μL、5‑10μM反向引物0.5‑1μL、预扩增产物1‑2μL、用水补足至25μL；PCR反应条件为：①94℃，5min预变性；②94℃，30s变性；③55℃，30s退火；④72℃，35s延伸；循环②至④35次；⑤72℃，5min；测序检测。