[发明专利]一种大肠杆菌水通道蛋白AQPZ中整合非天然氨基酸pPpa的方法有效
| 申请号： | 201610419991.6 | 申请日： | 2016-06-13 |
| 公开（公告）号： | CN106084017B | 公开（公告）日： | 2019-11-22 |
| 发明（设计）人： | 徐志南;庄冰佳;唐云平;蔡谨;黄磊 | 申请（专利权）人： | 浙江大学 |
| 主分类号： | C07K14/245 | 分类号： | C07K14/245;C12N15/31;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19 |
| 代理公司： | 33100 浙江杭州金通专利事务所有限公司 | 代理人： | 刘晓春<国际申请>=<国际公布>=<进入 |
| 地址： | 310058 浙江*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | 本发明提供一种大肠杆菌水通道蛋白AQPZ中整合非天然氨基酸pPpa的方法，包括：定点突变詹氏甲烷球菌的酪氨酸‑tRNA合成酶获得MjpPpaRS基因，将MjpPpaRS基因克隆到pIVEX2.4c质粒上，得到重组质粒pIVEX2.4c‑MjpPpaRS；将重组质粒pIVEX2.4c‑MjpPpaRS和pUC‑MjtRNA转化至大肠杆菌BL21，选取阳性转化子，发酵后制成大肠杆菌无细胞抽提物，建立无细胞表达体系；以pIVEX2.4c‑AqpZ为模板，对AQPZ的F10、F13和F17三个位点进行琥珀突变；向无细胞表达体系中添加去污剂可溶表达编入pPpa的AQPZ蛋白，利用亲和层析纯化获得定点编入pPpa的AQPZ蛋白。本发明利用大肠杆菌无细胞体系生产编入pPpa的AQPZ蛋白并利用亲和层析纯化获得该目标蛋白，非天然氨基酸的嵌入使得该水通道蛋白与磷脂的亲和性增强，使得相同的条件下水通道蛋白的嵌入后更稳定。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 大肠杆菌 通道 蛋白 aqpz 整合 天然 氨基酸 pppa 方法 | ||
【主权项】：
1.一种大肠杆菌水通道蛋白AQPZ中整合非天然氨基酸pPpa的方法，包括以下步骤：/n(1)定点突变詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的酪氨酸-tRNA合成酶(tyrosyl-tRNA synthetase,TyrRS)，获得具有5个突变位点的MjpPpaRS基因，所述MjpPpaRS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1，其突变位点为Tyr32Ala、Glu107Pro、Leu162Ala、Phe110Ala、Asp158Ala，构建获得p15a-MjpPpaRS质粒；将MjtRNA基因克隆至质粒pUC19，获得质粒pUC-MjtRNA，所述MjtRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2；/n(2)将步骤(1)得到的质粒p15a-MjpPpaRS和pUC-MjtRNA同时转至大肠杆菌BL21(DE3)中，选取阳性转化子，发酵后制成大肠杆菌无细胞抽提物，建立无细胞表达体系；/n(3)将MjpPpaRS基因克隆到pIVEX2.4c质粒上，获得重组质粒pIVEX2.4c-MjpPpaRS；/n(4)以pIVEX2.4c-AqpZ为模板，对AQPZ的F10、F13和F17三个位点进行琥珀突变，得到重组质粒pIVEX2.4c-AqpZTAG；/n(5)将步骤(3)得到的重组质粒pIVEX2.4c-MjpPpaRS和步骤(4)得到的载体pIVEX2.4cAqpZTAG加入步骤(2)获得的大肠杆菌无细胞体系中进行表达；/n(6)利用亲和层析分离纯化编入pPpa的AQPZ蛋白，并检测其滤水功能。/n
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