[发明专利]一种准确鉴别回捕褐牙鲆中放流鱼的方法

摘要

一种准确鉴别回捕褐牙鲆中放流鱼的方法，属于增殖放流领域，该方法首先进行形态学上区分，然后对褐牙鲆的线粒体DNA进行PCR扩增，通过倍型分析进一步确定疑似放流褐牙鲆，最后再分有针对性的进行荧光标记微卫星标记多重PCR扩增，确定放流个体，本发明方法减少了放流个体鉴定的盲目性，减轻了工作量，提高鉴定效率。

主权项

一种准确鉴别回捕褐牙鲆中放流鱼的方法，其特征在于所述方法的步骤为：a、形态学观察：观察回捕褐牙鲆无眼侧皮肤，具有黑化现象的为放流褐牙鲆；b、对无眼侧皮肤没有黑化现象的回捕褐牙鲆进行线粒体DNA标记PCR扩增：1)设计合成一对褐牙鲆线粒体DNA控制区引物序列：Dl‑d：5’‑CCCACCACTAACTCCCAAAGC‑3’和Dl‑s：5’‑TAGGAACCAAATGCCAGGAA‑3’；2)对无眼侧皮肤没有黑化现象的回捕褐牙鲆线粒体DNA进行PCR扩增：3)扩增结果经纯化、测序，然后统计单倍型；单倍型与褐牙鲆母本不一致的为非放流褐牙鲆，可以直接排除，单倍型一致的为疑似放流褐牙鲆；c、对疑似放流褐牙鲆进行荧光标记微卫星引物多重PCR扩增：1)构建3重PCR体系，对疑似放流褐牙鲆进行荧光标记微卫星标记3重PCR扩增，荧光标记微卫星引物序列见表1；表1微卫星引物序列2)毛细管电泳检测：将甲酰胺与分子量内标按100:1的体积比混匀后，取15μL加入上样板中，再加入1μL稀释10倍的PCR产物，然后使用3730XL测序仪进行毛细管电泳检测；3)数据分析：利用Genemarker中的Fragment片段分析软件对测序仪得到的原始数据进行分析，将各泳道内分子量内标的位置与各样品峰值的位置做比较分析，得到片段大小。然后与父本和单倍型一致的母本相同微卫星位点的片段大小进行对比，片段大小完全对应的为放流褐牙鲆。