[发明专利]一种基于CRISPR/Cas9技术消除mecA质粒的方法

摘要

本发明公开了一种基于CRISPR/Cas9技术消除mecA质粒的方法，选择MRSA菌株对mecA基因编码转肽酶C末端的DNA序列进行PCR扩增；mecA基因凝胶回收；mecA基因与T‑pMD19（simple）载体连接：制备DH5α感受态细胞；T‑pMD19‑mecA质粒电转DH5α感受态细胞；T‑pMD19‑mecA质粒的提取与测序验证；T‑pMD19‑mecA质粒的双酶切处理和mecA基因的凝胶回收；pET‑21a(+)质粒与mecA基因连接；oligos的设计、合成；pCas9∷mecA质粒的构建；电转pET‑21a(+)‑mecA质粒到大肠杆菌表达菌株BL21（D3）中；分别电转pCas9∷mecA质粒和pCas9质粒到BL21（D3）+pET‑21a(+)‑mecA感受态细菌与BL21（D3）+pET‑21a(+)感受态细菌中。本发明操作简单，特异性强，可以有效阻断mecA的传播消除MRSA菌株。

主权项

一种基于CRISPR/Cas9技术消除mecA质粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：选择MRSA菌株对mecA基因编码转肽酶C末端的DNA序列进行PCR扩增；mecA基因凝胶回收；将步骤（2）所得的mecA基因与T‑pMD19（simple）载体连接：制备DH5α感受态细胞；将步骤（3）所得产物电转DH5α感受态细胞取100μl所述 DH5α感受态细胞置于冰上解冻；取11μl步骤（3）所得产物置于离心管中，将离心管和电转杯一起置于冰上预冷10min；将100μl解冻的所述 DH5α感受态细胞转移到上述离心管中，冰上混匀后，继续冰浴10min；打开电转仪，将上述混合物转移至电转杯中，在2500V电压下进行电转，并将1ml 含有抗性的BHI 培养基迅速加入电转杯中，将其混匀后转移到10ml离心管中，37℃，250r/min 离心1.5h，进行复苏处理；取50μl上述混合物和50μl BHI培养基，混合均匀，然后涂在含有100μg/ml 氨苄西林的TSA平板上，置于37℃的保温箱内，过夜培养；T‑pMD19‑mecA质粒的提取与测序验证；T‑pMD19‑mecA质粒的双酶切处理和mecA基因的凝胶回收T‑pMD19‑mecA质粒经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后，进行凝胶电泳验证和mecA基因凝胶回收；pET‑21a(+)质粒的双酶切处理和凝胶回收pET‑21a（+）质粒采用质粒DNA小量提取试剂盒回收后进行BamHⅠ和Hind Ⅲ内切酶双酶切处理后，进行凝胶回收；pET‑21a(+) 质粒与mecA基因连接；oligos 的设计、合成、磷酸化及退火处理；pCas9∷mecA质粒的构建pCas9凝胶回收产物与退火的双链oligos连接体系：pCas9凝胶回收产物12μl ，稀释后的oligos 1.5μl，T4连接酶1μl，T4连接酶buffer 2μl，双蒸水3.5μl；连接条件：16℃下过夜连接，之后，电转100μl DH5α感受态细胞，选择单克隆菌落提取pCas9∷mecA质粒；电转pET‑21a(+)‑mecA质粒到大肠杆菌表达菌株BL21（D3）中；电转pCas9∷mecA质粒和pCas9质粒到BL21（D3）+pET‑21a(+)‑ mecA感受态细菌中；电转pCas9∷mecA质粒和pCas9质粒到BL21（D3）+pET‑21a(+)感受态细菌中。