[发明专利]一种极细链格孢菌激活蛋白的增产方法

摘要

本发明涉及一种极细链格孢菌激活蛋白的增产方法，该方法经过孢子的制备,孢子悬浮液的制备,以及在菌株液体培养时,在发酵培养基中加入β‑谷甾醇和甜菜碱，从而增加极细链格孢菌激活蛋白的产量；采取本发明，一是优化的培养基和培养条件使激活蛋白产量提高四倍多；二是培养基成分均源自植物，来源方便安全，价格便宜，便于规模化生产；三是研究了摇瓶发酵的动态参数，获得了适宜菌株生长的发酵培养基；研究了接种量、发酵培养基初始pH值、摇瓶装液量和温度等对发酵的影响，确定了极细链格孢菌产激活蛋白培养基组成，以及最适摇瓶发酵培养条件。

主权项

1.一种极细链格孢菌激活蛋白的增产方法，其特征在于具体步骤如下：（1）孢子的制备：在无菌操作台中，火焰保护下用接种针将-90～-70℃冻存管中保存的极细链格孢菌菌丝，涂布在PSA培养基平板上，放入培养皿中并将培养皿边缘用封口膜封死，在20～35℃的恒温条件下，在培养箱中倒置培养，直到其变黑产孢；（2）孢子悬浮液的制备：在无菌操作台中，取出培养皿中的PSA培养基平板，在PSA培养基平板上打取菌丝块，将一定量的已灭菌的0.05%吐温-20的蒸馏水均匀的倾注在菌丝块表面，将孢子与菌丝分离并悬浮在无菌水中，之后将菌悬液过滤后得到孢子悬浮液储存在无菌环境中备用；（3）极细链格孢菌液的培养：在无菌操作台中，将制备好的孢子悬浮液接入装有75～200mL发酵培养基的500 mL器皿中，每瓶接种3～20 mL，将接种后的器皿放入旋转式恒温摇床中，转速为120～200 r/min，培养温度为20～35℃，培养50～70h后即得；其中，按质量组份，发酵培养基为：1～5 g/L β-谷甾醇，1～5 g/L甜菜碱，12～18 g/L蔗糖，2～8 g/L玉米淀粉，15～25 g/L土豆淀粉，7～13 g/L谷氨酸，2～8 g/L胰蛋白胨，7～13 g/L黄豆粉，2～8 g/L硝酸钾；（4）激活蛋白的提取和含量测定：将500mL器皿中培养的极细链格孢菌液抽滤到定性滤纸上，将抽滤好的菌饼连同滤纸一起在烘箱中55～65℃干燥至恒重，将干燥后的菌饼研磨成粉末，加入激活蛋白提取缓冲液，振荡均匀，在2～6℃冰箱中放置10～30 min，在沸水浴中加热10～30 min，之后12000～14000 r/min离心10～20 min，取上清即得激活蛋白粗提液，使用双缩脲方法测定激活蛋白粗提液中激活蛋白的含量。/n