[发明专利]特异性识别EGFRvⅢ的含CD70嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法

摘要

本发明公开了一种特异性识别EGFRvIII的含CD70嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法，其步骤如下：A、质粒构建、扩增及纯化；B、慢病毒包装：1)培养包装细胞，2)准备DNA‑EndoFectin慢病毒混合物，3)转染包装细胞，4)收获慢病毒颗粒；C、T细胞转染：1)培养板预处理；2)病毒离心；3)T细胞转染。CAR‑T技术经历了三代发展，现在应用于临床实验的主要是第三代含双共刺激分子CAR。在此基础上，本发明加入了新共刺激分子CD70。在CAR‑T细胞中，CD70‑CD27的相互作用可诱导CD8+T细胞发挥更强的肿瘤杀伤及融病毒作用。因此，引入CD70的CAR‑T有着更加强大的抗肿瘤能力，将延长生存期。

主权项

一种特异性识别EGFRvIII的含CD70嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法，其特征在于所述方法步骤如下：A、质粒构建：构建慢病毒包装质粒pEGFP‑CD70CAR质粒；质粒扩增及纯化：在经紫外线照射后的超净台内剪携有pEGFP‑CD70CAR质粒的滤纸圈的1/3置于离心管中，加入无菌双蒸水浸泡30min，搅拌后离心取上清，置于‑20℃保存备用；将用于扩增质粒的感受态大肠杆菌DH5α加入到EP管中，加pEGFP‑CD70CAR质粒1μL/管，混匀后冰上静置30min；低温42℃热休克1.5～2min，置于冰中5分钟，加Luria‑Bertani培养基，摇床150rpm振摇45～60min，使细菌复苏并表达pEGFP‑EFGRvIII和pEGFP‑CD70CAR质粒氨苄青霉素AMP抗药性，将200μL已转化的感受态细胞转移到氨苄青霉素的固体培养基平板上，涂布均匀，干燥后，培养12‑16小时；挑取转化pEGFP‑EFGRvIII和pEGFP‑CD70CAR后Amp+平板上长出的单菌落放入到已加有3mL Amp+LB的试管中，180rpm振摇12‑16小时，依据质粒提取试剂盒质粒提取；B、慢病毒包装1)培养包装细胞在进行转染前，提前两天将1.3～1.5×10⁶的GeneCopoeia 293T细胞移入10厘米细胞板进行培养，板内加入完全培养基，融合率为70～80％时进行转染；2)准备DNA‑EndoFectin慢病毒混合物往无菌EP管加入pEGFP‑CD70CAR质粒和5.0ul LentiPac HIV混合试剂，以Opti‑MEM I培养基稀释至200μl；在另一无菌EP管内，以Opti‑MEM I稀释15ul EndoFectin转染试剂；边进行涡旋，边往DNA和LentiPac HIV试剂的混合溶液中滴加以上稀释EndoFectin转染试剂；室温培养该溶液10～25分钟，使DNA‑EndoFectin混合物产生；3)转染包装细胞将DNA‑EndoFectin慢病毒复合物直接加细胞板，分散复合物；过夜培养6～8小时，以加入2～5％热灭活胎牛血清、青霉素和链霉素的新鲜培养基更换旧培养基，培养基中加入1/500体积的TiterBoost试剂；4)收获慢病毒颗粒转染两天后收集培养基，以500g离心10分钟，可获得含慢病毒颗粒的培养基；离心后，以0.45μm的低蛋白结合PES过滤膜过滤该培养基；C、T细胞转染1)培养板预处理将20～100μg/ml的重组黏连蛋白Retro Nectin包被在未处理的24孔板上，4℃过夜；用2％牛血清蛋白BSA封闭半小时；用缓冲液冲洗三遍；2)病毒离心将病毒上清，即由步骤B获得的含病毒培养基以125～250μl/cm²的浓度加到预处理的24孔板上，4～6h，去除上清用PBS冲洗一次；3)T细胞转染管中预先加5ml人淋巴细胞分离液，取抗凝血5ml，与生理盐水1:1混匀后，缓慢滴入，以1500转/分离心20分钟，肉眼可见薄膜，吸取此处的单核细胞，放入含生理盐水10毫升的试管中，充分混匀后，以500g离心10分钟；弃液，沉淀经无菌PBS反复洗2次即得所需细胞；将用CD3刺激抗体OKT3及IL‑2激活的T细胞以0.2～1×10⁵个/ml的浓度加入，以2000g的离心力离心10min，孵育72h，即得特异性识别EGFRvIII的含CD70嵌合抗原受体修饰T细胞。