[发明专利]一种过氧化氢酶及其高产基因工程菌

摘要

本发明是一种新型来源的过氧化氢酶及其重组工程菌的构建。本发明在于：首次根据短小芽孢杆菌的过氧化氢酶基因设计引物并构建了重组表达载体。将载体转化至基因工程菌大肠杆菌及枯草芽孢杆菌进行异源表达。利用发酵培养基对重组工程菌进行5L发酵罐发酵培养，其中重组大肠杆菌的过氧化氢酶主要在胞内表达，酶活为6645U/mL，重组B.subtilis 168的过氧化氢酶总酶活达到23263U/mL，胞外酶活为15368U/mL，而在B.subtilis WB600的过氧化氢酶总酶活高达26635U/mL，胞外酶活为20128U/mL，利用B.subtilis WB600为宿主更有利于胞外合成过氧化氢酶，具有重要的工业应用价值。这是目前报道的利用微生物生产过氧化氢酶的最高产量，为其工业化生产提供了一种实际有效策略。

主权项

1.一种高产过氧化氢酶的基因工程菌，其特征在于：将来源于短小芽孢杆菌过氧化氢酶基因KatX2分别与表达载体pET-28a和pMA5-HpaII连接，构建重组表达载体pET-28a-KatX2及pMA5-KatX2，并将重组表达载体分别转化至枯草芽胞杆菌WB600中，构建枯草芽胞杆菌基因工程菌，并将其用于生产过氧化氢酶，所述的过氧化氢酶基因序列如SEQ No.1所示；/n将所述的枯草芽胞杆菌基因工程菌发酵生产过氧化氢酶，其步骤为：/n将枯草芽胞杆菌基因工程菌利用LB培养基活化，37℃、160r/min培养过夜后转接于2L发酵培养基中，接种量8％，培养温度37℃，转速300r/min，通气量1.0vvm，培养48h后，4℃，8000r/min离心10min收集发酵液及菌体，其中菌体用pH 7.0的50mM PB缓冲液洗涤二次，然后重悬于培养时同等体积的pH 7.0的50mM PB缓冲液中，利用60MPa弗氏细胞压碎器对细胞悬浮液进行细胞破碎；/n所述的培养基包括(g/L)：蔗糖25，胰蛋白胨5，玉米浆15，K₂HPO₄ 8，KH₂PO₄ 2，MgSO₄ 1，pH 7.2。/n