[发明专利]一种定性检测CAR‑T产物中VSVG序列污染的方法

摘要

本发明涉及一种应用在细胞免疫CAR‑T治疗的中的质量控制方法，具体涉及一种定性检测CAR‑T产物中VSVG序列污染的方法。本发明针对慢病毒生产现有技术的不足，根据CAR‑T生产的实际需要，设计了HIV中VSVG基因序列的Real‑Time PCR引物。使用此引物对CAR‑T产物进行Real‑Time PCR分析，能够有效监测CAR‑T中VSVG基因序列存在与否，为CAR‑T免疫细胞治疗技术应用的安全性提供了保障。

主权项

一种定性检测CAR‑T产物中VSVG序列污染的方法，其具体包括如下步骤：(1)Real‑Time PCR设计及选择：使用Primer Premier 5软件针对VSVG基因序列设计一组Real‑Time PCR引物和探针；并使用慢病毒包装系统中的pMD2.G质粒对引物和探针进行效率和特异性评估，选取荧光效果较好的一组Real‑Time PCR引物和探针进行后续检测；(2)标准曲线样品的制作：使用pMD2.G质粒作为标准品母液，提取感染前的淋巴细胞DNA稀释pMD2.G质粒，分别制成拷贝数1.600E+08，1.600E+07，1.600E+06，1.600E+05，1.600E+04，1.600E+03，1.600E+02的一组标准品溶液；向反应管内加入荧光剂，使用选取的Real‑Time PCR引物对CAR‑T产物和阴性对照进行Real‑Time PCR，确定各反应管荧光信号到达设定阈值所经历的循环数Ct；(3)CAR‑T产物基因组提取及Real‑Time PCR：选取CAR‑T产物作为待测样品，提取基因组DNA，并进行DNA浓度和纯度分析，同时，提取原始T细胞的基因组DNA，定量至90ng/μL作为阴性对照；向反应管内加入荧光剂，使用选取的Real‑Time PCR引物对CAR‑T产物和阴性对照进行Real‑Time PCR，确定各反应管荧光信号到达设定阈值所经历的循环数Ct；(4)定性判定CAR‑T产物是否存在VSVG污染：比较待测样品的Ct值，各标准曲线的Ct值以及阴性对照的Ct值，若待测样品与阴性对照的扩增曲线一致，且Ct值大于阳性对照时，认为该样品中无VSVG污染存在；若待测样品与阴性对照的扩增曲线存在明显差异，且待测样品Ct值小于阴性对照认为该样品中VSVG存在污染。