[发明专利]人胚胎干细胞定向诱导分化为角膜内皮细胞的方法

摘要

本发明提供人胚胎干细胞定向诱导分化为角膜内皮细胞的方法，包括人胚胎干细胞诱导分化为人神经嵴干细胞以及人神经嵴干细胞诱导分化为人角膜内皮细胞等步骤。本发明利用原代人角膜基质细胞培养上清液、人角膜内皮细胞培养上清液以及人晶状体细胞培养上清液作为条件培养基，通过向培养基中添加维甲酸和多种重组蛋白，结合三维培养和二维培养方法，模拟角膜内皮细胞发育进程诱导人胚胎干细胞定向诱导分化为人角膜内皮细胞，能够获得形态结构与正常人角膜内皮细胞相似的人角膜内皮细胞，体外传代培养结果显示其增殖能力与正常人角膜内皮细胞一致。

主权项

1.用于人胚胎干细胞定向诱导分化为角膜内皮细胞的培养基，其特征在于，包括用于人胚胎干细胞诱导分化为人神经嵴干细胞的培养基以及用于人神经嵴干细胞诱导分化为人角膜内皮细胞的培养基；/n其中，所述用于人胚胎干细胞诱导分化为人神经嵴干细胞的培养基的制备方法如下：/nS11、取角膜移植术后剩余供体角巩膜环，倒置显微解剖镜下使用显微角膜剪去除残余结膜、葡萄膜及巩膜组织，保留角膜缘部分；/nS12、用含1％青链霉素的DMEM-F12培养液清洗组织2遍后，将组织置于2～4U/mlDispaseⅡ液中4℃消化过夜；/nS13、倒置显微镜下使用有齿角膜镊撕除角膜内皮层，将剩余的条状角膜缘组织剪成2mm²组织块，置于1～2.5mg/ml胶原酶液中，37℃消化1-2小时；/nS14、取DMEM-F12+5～10％FBS+1％青链霉素培养液10ml用于重悬消化后的组织块；/nS15、1500rpm离心4分钟，收集沉淀，将沉淀吹打均匀，接种于10cm培养皿中，于37℃，5％CO₂培养箱中培养3～5天；进行首次换液，更换培养基为角膜基质细胞分化培养基，然后每2～3天换液，细胞融合度至80％进行传代；/nS16、待传代后细胞融合度在70～90％时弃培养基，用无菌PBS漂洗培养瓶一次，按照200μl/cm²的比例添加HCSC分化培养基，继续培养12h，收集细胞培养上清液，即得所述用于人胚胎干细胞诱导分化为人神经嵴干细胞的培养基，用0.22μm滤器过滤，-80℃保存备用；/n其中步骤S15中所述角膜基质细胞分化培养基的配方如下：DMEM-F12培养基88mL、B27培养基2mL、5～20ng/mL表皮生长因子、10～40ng/mL重组人碱性成纤维生长因子和10％胎牛血清10mL；/n所述用于人神经嵴干细胞诱导分化为人角膜内皮细胞的培养基，所述培养基包括S1CM、S2CM和S3CM，它们的制备方法如下：/nS21、将液氮中保存的人角膜内皮细胞系复苏至预先包被10μg/mL层粘连蛋白及10mg/mL硫酸软骨的T25培养瓶中，细胞按照3×10⁵个/瓶的密度接种于T25培养瓶，于37℃，5％CO₂培养箱中静置培养，使用的培养基为含10ng/mL重组人碱性成纤维生长因子的Human-Endothelial-SFM；待细胞融合度在70-90％时弃培养基，用无菌PBS漂洗培养瓶一次，按照200μL/cm²的比例添加上述含10ng/mL重组人碱性成纤维生长因子的Human-Endothelial-SFM，继续培养12h，收集人角膜内皮细胞培养上清液；用0.22μm滤器过滤后，-80℃保存备用；/nS22、液氮中保存的人晶状体上皮细胞系经复苏后置于T25培养瓶内，于37℃，5％CO₂培养箱中静置培养，使用的培养基为含10％FBS的DMEM-F12；待细胞融合度在70-90％时弃培养基，用无菌PBS漂洗培养瓶一次，按照200μL/cm²的比例添加上述含10％FBS的DMEM-F12，继续培养12h，收集人晶状体上皮细胞培养上清液，-80℃保存备用；/nS23、将S21的人角膜内皮细胞培养上清液与S22的人晶状体上皮细胞培养上清液分别按照1:3、1:2和1:1的体积比混合，即分别得到培养基S1CM、S2CM和S3CM，用0.22μm滤器过滤后，-80℃保存备用。/n