[发明专利]油菜双单倍体诱导系规模化创造油菜遗传稳定群体的方法

摘要

本发明油菜双单倍体诱导系规模化创造油菜遗传稳定群体的方法，包括：1）根据研究需求选择目标性状;2)根据目标性状选择具有该目标性状差异较大的两个亲本材料;3）两个亲本材料杂交；4）用油菜双单倍体诱导系给亲本杂交F₁代授粉；4)诱导后代遗传稳定性鉴定；5）诱导后代目标性状调查形成遗传稳定的遗传群体。本发明可在油菜3个栽培种（甘蓝型油菜（2n=38）、白菜型油菜(2n=20)、芥菜型油菜（2n=36））中都可运用，可以快速（3代）、规模化获得遗传稳定的DH（Double Haploid）群体，对油菜基础研究特别是遗传作图群体用于基因定位、基因精细定位、QTL分析具有明显的促进作用，降低油菜基础研究的周期和人力、物力投入。

主权项

油菜双单倍体诱导系规模化创造油菜遗传稳定群体的方法，包括以下步骤：1)对具有目标性状差异明显的2个遗传稳定油菜进行人工去雄杂交，并收获杂交后代F₁种子；2)对上述步骤1）中收获的杂交后代植株在现蕾初期进行化学杀雄；根据化学杀雄剂不同或油菜材料不同提前进行浓度摸索和比较试验，保证化学杀雄彻底，化学杀雄剂的作用浓度为30—150ppm；3)在油菜花期，利用油菜双单倍体诱导系对上述步骤2）中化学杀雄后的杂交F₁植株进行人工授粉，或将油菜双单倍体诱导系与上述步骤2）化学杀雄杂交F₁植株种植在一个隔离网室，采用壁蜂辅助授粉，接受授粉的母体植株至少在100株以上；4)对上述步骤3）中用油菜双单倍体诱导系授粉后代进行单株种植，苗期利用流式细胞仪鉴定倍性，淘汰多倍体、单倍体或具有油菜双单倍体诱导系显性性状特征植株，选择正常育性，正常倍性植株，单株套袋自交，选择套袋自交单株数在5000株以上；5)对上述步骤4）中单株自交后代进行株系种植，调查株系形态一致性，并通过分子标记鉴定株系一致性及稳定性；6)上述步骤5）中所鉴定的株系数至少在2000个以上,并对遗传稳定株系再进行目标性状统计，分析目标性状是否符合正态分布；7）上述步骤6）中所有遗传稳定株系，即DH群体，满足目标性状正态分布，确定这些DH群体构建合格，用于油菜目标性状的遗传作图、目标性状基因定位、QTL分析、以及目标性状与基因的关联分析；上述步骤3）中油菜双单倍体诱导系的选育方法如下：（1）选育具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系：①将两个油菜亲本材料杂交F₁代种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行人工染色体加倍获得加倍后的F₁代植株；②加倍后的F₁代植株进行自交或强制自交获得F₂代，对F₂代进行田间种植观察，并鉴定每个单株的育性，选择可育后代自交获得F₃代，对F₃代进行纯合度鉴定，通过形态、细胞学以及分子标记鉴定，对后代DNA进行聚合酶链反应扩增，电泳观察每个特异引物扩增下单株的DNA带型及条带数目，显示每个单株都是两个亲本的杂交后代，每个单株之间分子标记图谱一致，说明这些单株是纯合系‑‑‑早代稳定系;③获得的早代稳定系与至少10个油菜常规纯合稳定系进行正反交，F₁代、F₂代鉴定早代稳定系的遗传特性，即是否有孤雌生殖特性；上述正反交，如有F₁分离，F₂代出现部分稳定株系，对应的早代稳定系是具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系；（2）选育携带显性遗传性状、具有孤雌遗传特性且倍性遗传稳定的多倍体油菜：①具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系与具有显性性状油菜杂交，得到杂交F₁代种子，上述杂交F₁种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行人工染色体加倍，得到加倍后的带显性性状的F₁植株；②对加倍的带显性性状的F₁植株，通过显微观察或流式细胞仪进行染色体倍性鉴定，选择带显性性状的多倍体的植株，淘汰非正常加倍株、非整倍体植株、以及不带显性性状加倍植株，带显性性状的多倍体的植株主要是倍性遗传稳定、结实性好、具有孤雌生殖遗传特性、带显性性状的六倍体或八倍体油菜植株；（3）油菜双单倍体诱导系鉴定及诱导能力测定：①倍性遗传稳定、具有孤雌生殖遗传特性、带显性性状的多倍体植株中的显性性状能去除测交后代中产生的杂交株，如果测交后代中出现显性性状植株、或非整倍体植株，说明该植株是多倍体植株和母本杂交产生的，去除该植株；②上述单株测交后代如果出现全不育、为正常倍性油菜即二倍体或四倍体油菜、且不带显性性状，说明该测交后代对应的父本基因未进入测交后代中，显性多倍体植株为油菜双单倍体诱导系。