[发明专利]一种在大肠杆菌中制备线性单链DNA的方法有效
| 申请号： | 201610464596.X | 申请日： | 2016-06-23 |
| 公开（公告）号： | CN106119269B | 公开（公告）日： | 2019-12-06 |
| 发明（设计）人： | 张平静;冯文建;杨扬;王晋康;朱远源 | 申请（专利权）人： | 百奥迈科生物技术有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N15/113;C12N15/10 |
| 代理公司： | 31280 上海申浩律师事务所 | 代理人： | 贾师英<国际申请>=<国际公布>=<进入 |
| 地址： | 226016 江苏省*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种用于制备线性单链DNA的方法，其包括：构建可表达Cas切口酶的Cas表达元件，整合入质粒；构建可在大肠杆菌细胞中与上述Cas表达元件兼容的sgRNA基因转录表达元件，并构建成质粒，得到sgRNA表达质粒；将Cas切口酶表达质粒和sgRNA表达质粒共同转化到大肠杆菌感受态细胞中；培养大肠杆菌至对数生长期，诱导Cas切口酶基因表达和自杀性sgRNA表达，Cas切口酶协同sgRNA自剪切sgRNA表达质粒的双链DNA并形成单链断裂，产生线性单链DNA；提取线性单链DNA。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 大肠杆菌 制备 线性 dna 方法 | ||
【主权项】：
1.一种在大肠杆菌中制备线性单链DNA的方法，包括如下步骤：/nA)构建可表达Cas切口酶的Cas表达元件，该Cas表达元件包含操纵子、启动子、Cas切口酶基因序列、终止子、复制子和筛选标记基因，所述Cas切口酶是来源于化脓链球菌的spCas9或来源于金黄色葡萄球菌的saCas9；/nB)将步骤A)中得到的Cas表达元件整合入质粒或基因组，得到Cas切口酶表达质粒；/nC)构建可在大肠杆菌细胞中与上述Cas表达元件兼容的sgRNA基因转录表达元件，其包含操纵子、启动子、sgRNA基因序列、终止子、复制子和筛选标记基因，/nD)将步骤C)中得到的sgRNA基因转录表达元件构建成质粒，得到sgRNA表达质粒，该质粒上包含作为自杀sgRNA靶点的PAM序列和对应于所述线性单链DNA的序列；/nE)将步骤D)中得到的sgRNA表达质粒和步骤B)中得到的Cas切口酶表达质粒共同转化到大肠杆菌感受态细胞中；/nF)培养大肠杆菌至对数生长期，诱导Cas切口酶基因表达和自杀性sgRNA转录表达，Cas切口酶协同sgRNA自剪切sgRNA表达质粒的双链DNA并形成单链断裂，通过质粒的θ复制机制协同作用产生线性单链DNA；/nG)提取sgRNA基因转录表达元件自剪切的DNA产物中的线性单链DNA。/n
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