[发明专利]一种利用CRISPR-Cas9靶向敲除ALK6基因的方法

摘要

本发明公布了一种利用CRISPR‑Cas9靶向敲除ALK6基因的方法，该方法通过对多物种进行同源对比选取两对ALK6基因靶序列，利用gRNA的PAM设计原则，合成两对靶序列不同，表达的蛋白相同，带有相同BsmBI粘性末端的DNA双链，将双链与pPDNA330质粒进行连接得到携带有多物种的ALK6同源基因的重组载体，重组载体利用荧光蛋白表达法对基因敲除效率进行检测，选择敲除效率更高的载体转染多物种受体细胞，进行基因敲除并验证，完成对多物种ALK6基因进行简单、高效、精确的基因敲除。

主权项

一种利用CRISPR‑Cas9靶向敲除ALK6基因的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)构建pPDNA330‑ALK6‑1和pPDNA330‑ALK6‑2载体，构建方法如下：A、从基因数据库中下载多物种ALK6基因的核苷酸序列，并进行同源比对选取两对靶序列，分别为ALK6靶序列1：5’‑ATGATAGAAGAAGATGACTC‑3’和ALK6靶序列2：5’‑GGATCAGGCCTCCCTCTGC‑3’；B.根据同源对比结果和gRNA的PAM设计原则，合成两对与靶序列不同，表达的蛋白相同，带有相同BsmBI粘性末端的DNA双链，分别命名为：ALK6‑1和ALK6‑2；C.用BsmBI酶切pPDNA330质粒，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，再进行切胶回收；D.用连接酶将ALK6‑1和ALK6‑2分别与BsmBI酶切后的pPDNA330质粒进行连接，得到重组质粒载体，分别命名为：pPDNA330‑ALK6‑1和pPDNA330‑ALK6‑2；(2)对重组质粒载体pPDNA330‑ALK6‑1和pPDNA330‑ALK6‑2进行敲除效率的筛选验证、对比，选择ALK6基因敲除效率更高的重组质粒载体转染受体细胞；(3)转染不同物种的受体细胞，收集转染之后的受体细胞，并提取细胞基因组进行测序，根据基因组测序结果合成检测引物进行PCR扩增，扩增产物连接入pEASY‑T1载体，挑取单克隆细菌，进行测序，对ALK6基因敲除表达结果进行检测。