[发明专利]基于实时荧光定量PCR 检测小麦根际土壤中丛枝菌根真菌数量的方法

摘要

本发明提供一种基于实时荧光定量PCR 检测小麦根际土壤中丛枝菌根真菌数量的方法，首先提取小麦根际土壤样本总DNA作为PCR扩增的模板，然后以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为引物扩增获得129bp的特异性片段，经连接、转化后，再以qPCR扩增；本发明方法法不仅鉴定了丛枝菌根，并且可以准确的对其进行绝对定量，得到在转基因小麦各个生育期丛枝菌根真菌的拷贝数，在小麦生长发育阶段，丛枝菌根拷贝数的变化总体呈现逐渐增加的趋势，本发明建立了快速、简便而精确的鉴定方法，为后续试验提供了理论和试验依据，对进一步评价转基因作物的安全性具有重要意义，与现有方法相比，本发明方法敏感性高，特异性强，重复性好，操作方便，结果直观。

主权项

一种基于实时荧光定量PCR 检测小麦根际土壤中丛枝菌根真菌数量的方法，其特征在于，具体步骤如下：A）提取小麦根际土壤样本总DNA，溶于ddH₂O中；B）以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为引物，以小麦根际土壤样本总DNA为模板，进行PCR扩增，获得长度为129bp的特异性片段；C）对步骤B）获得的129bp特异性片段切胶回收，然后与T4载体连接，转化进入大肠杆菌感受态细胞TOP10中，涂布于氨苄抗性平板，置于37℃环境中培养24小时，然后挑选单克隆于液体LB培养基培养24小时，提取质粒；以质粒为模板进行PCR扩增，所获得的阳性质粒即为目标质粒； D）以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为引物，以目标质粒为模板，进行荧光定量PCR扩增，根据标准曲线计算即可获得小麦根际土壤样本中丛枝菌根真菌的含菌量；所述标准曲线为Y=‑3.327X+42.913，R²=0.99874，其中Y为荧光时实定量PCR反应的Ct值，X为丛枝菌根真菌的标准质粒拷贝数对数值；所述液体LB培养基：在950ml ddH₂O中加入胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、用1M的NaOH调节pH值到7.0，定容至1L；氨苄抗性平板：向1L液体LB培养基加入15g琼脂粉，121℃，20min高压灭菌，冷却至50‑60℃时加入氨苄青霉素至期终浓度为50‑100mg/L，然后用培养皿制备平板，即得。