[发明专利]利用毕赤酵母表达系统分泌生产人源核心岩藻糖基转移酶的方法

摘要

本发明提供了一种在毕赤酵母表达系统中生产高效分泌表达核心岩藻糖基转移酶FUT8的方法，属于基因工程领域和蛋白质工程领域。该方法主要包括三个部分：重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8毕赤酵母分泌表达体系的构建、重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8的分离纯化和重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8酶活性的检测。本发明合成并分泌表达的核心岩藻糖基转移酶FUT8可广泛用于该蛋白抑制剂、生物学功能和体外寡糖研究，同时，合成的成本低，合成的周期短，技术操作上容易，所得FUT8的纯度高。

主权项

利用毕赤酵母表达系统分泌生产人源核心岩藻糖基转移酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：按照Protein Data Bank(UniProtKB‑Q9BYC5)人源核心岩藻糖基转移酶结构信息设计融合蛋白序列，利用RCSB PDB公布核心岩藻糖基转移酶蛋白信息去除核心岩藻糖基转移酶N端与高尔基体膜结合的跨膜区域，并在剩余序列的N端引入alpha信号肽，在C端的终止密码子前引入6个His氨基酸，用于分离纯化标签，方便后续的蛋白质纯化，蛋白质标签为组氨酸(6XHis)，氨基序列表SEQ ID No.1；利用毕赤酵母密码子偏好性合成核心岩藻糖基转移酶FUT8基因，是在不改变核心岩藻糖基转移酶FUT8氨基酸序列的基础上，按照毕赤酵母偏好性密码子对核心岩藻糖基转移酶FUT8全基因序列进行优化并合成，同时在核心岩藻糖基转移酶FUT8的5，端和3，端引入酶切位点，其核苷酸序列表为SEQ ID No.2；所述的毕赤酵母为毕赤酵母菌细胞X‑33；步骤2：利用限制性内切酶构建重组表达质粒pPICZαA‑FUT8，方法是：将步骤(1)中合成的重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8与表达质粒载体pPICZαA，利用限制性内切酶进行酶切，回收目的片段，利用T4 DNA连接酶将FUT8的酶切片段与质粒载体X酶切片段连接，得到重组表达质粒pPICZαA‑FUT8，转化到大肠杆菌TP10中进行扩增；步骤3：利用限制性内切酶对重组表达载体pPICZαA‑FUT8进行线性化后转化毕赤酵母菌细胞X‑33的感受态细胞，应用含抗生素的YPDS平板筛选出诱导型阳性转化子；步骤4：表达重组蛋白FUT8毕赤酵母菌株的发酵筛选：步骤(3)筛选出的诱导型阳性转化子在BMGY培养基中培养OD600＝2‑6时,换培养基为BMMY进行重组蛋白的诱导表达，诱导2‑4天，发酵液上清以SDS‑PAGE检测蛋白质表达量并用蛋白印迹方法检测是否为核心岩藻糖基转移酶，筛选出诱导型高水平分泌表达重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8的毕赤酵母重组菌株；步骤5：毕赤酵母重组菌株发酵上清液中分离纯化重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8。