[发明专利]一种适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞系的制备方法及通过该制备方法获得的MDCK细胞系

摘要

本发明公开了一种适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞系的制备方法及通过该制备方法获得的MDCK细胞系，包括以下步骤：1)弃去培养MDCK细胞的培养基，用胰酶溶液清洗细胞层后弃去溶液；再次加入胰酶溶液对MDCK细胞进行消化；待细胞变圆后终止消化；然后将细胞悬液离心后弃上清，获得细胞团；2)将步骤1)中获得的细胞团用无血清培养基进行重悬，获得细胞重悬液；3)将步骤2)中获得的细胞重悬液置于摇床中并放入培养箱中培养，用无血清培养基将细胞重悬液稀释，进行传代，得到MDCK细胞系；该MDCK细胞系的细胞密度高，呈单个分散生长，形态饱满，大小均一，活性大，适用于生物反应器无血清悬浮培养。

主权项

1.一种适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞系的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)将需血清贴壁培养的MDCK细胞用10％新生牛血清的DME M培养基培养至细胞汇合度达到80～90％时，弃去10％新生牛血清的DMEM培养基，用胰酶溶液清洗细胞层后弃去溶液；再次加入胰酶溶液至覆盖MDCK细胞进行消化5～15min；待细胞变圆后加入含胎牛血清的培养基终止消化；然后收集细胞悬液，并将细胞悬液离心后弃上清，获得细胞团；2)将步骤1)中获得的细胞团用无血清培养基进行重悬至细胞密度1.3～1.6×10⁶cells/mL，获得细胞重悬液；3)将步骤2)中获得的细胞重悬液加入方瓶，在转速30rpm、温度37℃、5％CO₂的条件下置于摇床中并放入培养箱中培养，经过2代培养后将培养的细胞重悬液转入摇瓶，转速提升至120rpm；每隔48h用新鲜的无血清培养基将细胞重悬液稀释至细胞密度为1.3～1.6×10⁶cells/mL，进行传代，获得适应无血清全悬浮培养的MDC K细胞系；所述无血清培养基中，各组分的浓度为：基础代谢营养物:核苷酸:维生素:无机盐：酸碱度缓冲剂：碳酸氢钠                    1000～3000mg/L；酸碱度指示剂：酚红                        5～15mg/L；流感病毒增殖促进剂：其它添加物：