[发明专利]双层流动腔系统力学微环境下HSCs与EPCs分层共培养工具和方法

摘要

本发明通过独特双层流动腔系统力学微环境下HSCs与EPCs分层共培养工具，构建了Epc(内皮祖细胞)和Hsc(肝形状细胞)共培养用细胞培养小室以及与之配合的孵育盒，公开了一种双层流动腔系统力学微环境下HSCs与EPCs分层共培养方法，解决了两种细胞分层培育的难题，分层共培养方法使不同处理因素的细胞，在相同实验条件下同时进行实验，最大程度地保证了实验结果的准确性和稳定性。

主权项

1.双层流动腔系统力学微环境下HSCs与EPCs分层共培养方法，该方法采用的双层流动腔系统力学微环境下HSCs与EPCs分层共培养工具包括孵育盒、盒盖和细胞培养小室，所述细胞培养小室包括桶形的体部，所述体部的底部设有Biopore膜，所述体部的顶部设有伸向外周的悬挂齿，所述孵育盒上设有正置凹洞和倒置凹洞，所述正置凹洞的半径大于细胞培养小室的体部半径且小于悬挂齿最外端至体部中心的半径；所述倒置凹洞半径大于悬挂齿最外端至体部中心的半径；所述孵育盒上的正置凹洞和倒置凹洞分别设有若干个；该方法包括以下步骤：A.EPCs的培养，EPCs的培养包括以下步骤：A1.EPCs原代培养；A2.EPCs细胞传代；B.HSCs的培养；C.孵育盒预处理；D.种植EPCs：将EGM‑2完全培养液、0.25％胰蛋白酶和1×PBS置于37℃水浴槽预热，预热后用酒精消毒转移至超净台；将预处理好后的孵育盒置于超净台中，孵育盒中加入适量EGM‑2完全培养液；吸取0.25％胰蛋白酶加入EPCs培养瓶中进行消化，30秒后倒掉胰蛋白酶，显微镜下观察细胞呈单个分离状态时转移至超净台，加EGM‑2完全培养液终止消化，吹打至镜下观察细胞全部与培养瓶分离后，将EPCs细胞均匀接种到细胞培养小室的Biopore膜的底面；E.在超净台中，将种植好EPCs的细胞培养小室倒置于孵育盒的倒置凹洞中，封闭孵育盒，静置30分钟；F.种植HSCs：将细胞培养小室取出，将其正置于孵育盒的正置凹洞中；用DMEM高糖和EGM‑2完全培养液吹打HSCs培养瓶中的HSCs细胞，将悬浮的HSCs细胞接种在细胞培养小室的Biopore膜的正面，盖上盒盖封闭孵育盒，静置30分钟；G.将共培养EPCs和HSCs细胞的孵育盒作通气处理后，置于培养箱培养；每天观察细胞生长状况，2‑3天后换液；F.换液后，显微镜下观察共培养细胞的生长状况，达到细胞集落相对密集，形态典型，细胞生长良好的要求时，将共培养细胞的细胞培养小室取出，固定于流槽上，置于双层流动腔系统力学微环境下流6‑24小时；其中，该方法中步骤A1.EPCs原代培养包括以下步骤：A1.1.SD大鼠颈椎脱臼处死，置入1000ml大烧杯内，以75％的酒精浸泡15分钟；A1.2.将大鼠从酒精中取出置于托盘上，用高压消毒处理好的剪刀、止血钳无菌条件下取大鼠四肢，将取下的大鼠四肢置于含75％酒精的玻璃平皿内浸泡后将其转移入超净台内；A1.3.将用锡纸包裹的蛙板于超净台内打开，大鼠四肢置于蛙板上；用剪刀、手术刀将大鼠四肢肌肉组织剔除，将四肢长骨放入含1×PBS的玻璃平皿内；A1.4.去除四肢长骨两端骨骺，置于另一玻璃平皿内；A1.5.用刻度吸管吸取PBS冲洗骨头，后用注射器插入骨髓腔反复冲洗，直至骨髓腔变白；A1.6.将冲洗出的液体用胶头滴管吹打混匀，置离心机1100rpm/min离心5分钟；A1.7.弃上清，加PBS吹打均匀，置离心机1100rpm/min离心5分钟；A1.8.弃上清，加3mlPBS吹打均匀，吹打成单个细胞制成细胞悬液；A1.9.取15ml离心管，底层加入梯度离心液4ml；将细胞悬液3ml加在梯度离心液上层，形成双层液，两层液体不能混合；置离心机梯度离心700g 23℃,离心25分钟；A1.10.取培养瓶，以Fn液打底后放于含5％CO2的37℃培养箱内；A1.11.梯度离心结束后，吸取中间云雾状乳白色层液体，置于离心管内，加入PBS吹打均匀清洗两次，第一次吹打清洗后置离心机1300rpm/min，离心5分钟，第二次1100rpm/min，离心5分钟；A1.12.从培养箱中取出培养瓶吸走Fn；在培养瓶侧壁上标明细胞名称、传代时间及操作者；A1.13.将上述清洗离心结束后所得EPCs细胞用EGM‑2培养液重悬后置入培养瓶，每瓶约4ml重悬液，放于培养箱内孵育；A1.14.培养4天后观察换液；其中，该方法中步骤A2.EPCs细胞传代包括以下步骤：观察EPCs细胞铺满至细胞培养瓶底面积的90％时进行传代：A2.1.将EGM‑2完全培养液、0.25％胰蛋白酶和1×PBS置于37℃水浴槽预热，预热后用酒精消毒，然后转移至超净台；A2.2.取出EPCs培养瓶，拧紧瓶盖转移至超净工作台内，弃培养液，用胶头滴管吸取1×PBS入培养瓶，轻晃培养瓶后倒掉，重复两次；A2.3.吸取0.25％胰蛋白酶进行消化，30秒后倒掉胰蛋白酶，显微镜下观察EPCs细胞呈单个分离状态时，转移至超净台，加EGM‑2完全培养液终止消化；A2.4.吹打直至镜下观察EPCs细胞全部与培养瓶分离；A2.5.将EPCs细胞均匀接种到培养瓶里；A2.6.在培养瓶侧壁上标明细胞名称、传代时间及操作者；A2.7.拧松瓶盖放入含5％CO2的37℃培养箱内培养；A2.8.待EPCs细胞铺满至细胞培养瓶底面积的90％时再次传代。