[发明专利]一种凝血因子Ⅷ亲和层析树脂的制备方法

摘要

本发明公开了一种凝血因子Ⅷ亲和层析树脂的制备方法。首先称取保存的琼脂糖凝胶进行洗涤处理，然后采用环氧氯丙烷活化法进行活化凝胶，得到活化凝胶；将得到的活化凝胶与间隔臂分子N‑羟基琥珀酰亚胺进行手臂连接反应，得到手臂连接的凝胶；将得到手臂连接的凝胶与肽配基进行配基偶联反应；偶联反应所得产物进行处理反应得到凝血因子Ⅷ亲和层析树脂；所得树脂进行洗涤处理，最后于凝胶体积3倍的20％乙醇溶液中在4℃条件下存放。将本发明产品层析树脂用于从血浆中提取凝血因子Ⅷ，能够快速、特异、高效的纯化凝血因子Ⅷ。

主权项

1.一种凝血因子Ⅷ亲和层析树脂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：a、首先称取保存于冰箱中20％乙醇水溶液中的琼脂糖凝胶Sepharose CL‑6B即琼脂糖凝胶CL‑6B，采用过量蒸馏水进行反复洗涤，除去琼脂糖凝胶表面的乙醇，得到湿琼脂糖凝胶；b、环氧氯丙烷活化法活化凝胶：称取步骤a所得湿琼脂糖凝胶，置于0.1～0.5M的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的体积量是湿琼脂糖凝胶重量的3～5倍；然后在25～35℃条件下恒温震荡0.5～2h，恒温震荡时振动速度为100～200转/min；震荡后取出凝胶进行充分水洗，水洗后进行真空抽滤，然后加入到1mol/L的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的体积量是凝胶重量的3～5倍；然后在20～30℃、180～220转/分条件下恒温振荡30～40分钟；震荡后静置30～40min，将上清液弃去，得到沉淀凝胶；得到沉淀凝胶后，以占沉淀凝胶体积百分比50％的二甲基亚矾或占沉淀凝胶体积百分比50％的1,4‑二氧六环为活化溶剂，并加入占沉淀凝胶体积百分比20％的环氧氯丙烷，在25～35℃、180～220转/分条件下恒温振荡反应9～12h；反应结束后对所得产物进行抽滤，抽滤后所得产物采用蒸馏水反复洗涤至滤液为中性，洗涤后进行抽滤，得到活化凝胶；c、手臂连接：将步骤b所得活化凝胶与间隔臂分子N‑羟基琥珀酰亚胺NHS悬浮于2mol/L、酸碱度为9.5的碳酸盐缓冲溶液中，所述活化凝胶与间隔臂分子之间加入量的摩尔比为1:5～8，所述碳酸盐缓冲溶液的加入量为活化凝胶体积的3倍；然后在55～65℃、180～220转/分条件下恒温振荡1～1.5h，进行“手臂”分子键合反应；反应后得到手臂连接的凝胶；d、配基偶联反应：称取步骤c所得手臂连接的凝胶，加入与间隔臂分子N‑羟基琥珀酰亚胺NHS等摩尔数的肽配基及碳化二亚胺EDC，在25～35℃、180～220转/分条件下恒温振荡进行配基偶联反应1.5～2.5h；所述肽配基为肽配基EYCPC、肽配基GCVSGCLCWEYC和肽配基RKWNCTDHEYC中的至少一种；e、称取步骤d偶联反应所得产物，加入所得产物溶液体积1/10的1mol/L的醋酸水溶液，在25～35℃、100～200转/min条件下恒温振荡2～2.5h；震荡后所得产物装入层析柱中将液体抽滤后，采用去离子水洗涤3～4次；每次加入去离子水的体积为湿凝胶5倍体积；洗涤后加入湿凝胶体积1/2的1mol/L的乙醇胺，接着在25～35℃、100～200转/min条件下恒温振荡反应2～2.5h；所得产物即为凝血因子Ⅷ亲和层析树脂；f、将步骤e所得产物采用去离子水冲洗，最后再用20％乙醇溶液冲洗3～4次，每次加入的乙醇溶液体积为湿凝胶5倍体积；冲洗后将所得产物存放于凝胶体积3倍的20％乙醇溶液中在4℃条件下存放。