[发明专利]酸性耐高温α-淀粉酶的生产方法

摘要

本发明公开了一种酸性耐高温α‑淀粉酶的生产方法，选用基因改良的枯草芽孢杆菌，通过平皿培养、摇瓶培养、种子罐发酵、发酵罐发酵、酶的提取制得，该生产方法采用的经过基因工程改良的枯草芽孢杆菌不会产生芽孢、适应能力强、不容易染菌、活力高、周期短。生产过程中通过调整风量控制，培养基的配比以及有效控制pH，最终制得的酸性耐高温α‑淀粉酶最佳反应条件在90‑110℃、pH在4.0‑5.5，酶活力达到40000U/mL，发酵周期仅为120小时，是目前国内在最短的发酵周期内酶活力最高的耐酸性淀粉酶。

主权项

超酸性耐高温α‑淀粉酶的生产方法，选用基因改良的枯草芽孢杆菌，通过平皿培养、摇瓶培养、种子罐发酵、发酵罐发酵、酶的提取制得，其特征在于：其步骤如下：（1）平皿培养：培养基配方：蛋白胨：0.5‑1.5%，酵母粉：0.1‑0.3%，牛肉粉：0.1‑0.5%，氯化钠：0.1‑0.3%，葡萄糖：3‑7%，玉米淀粉：0.5‑1.5%，琼脂粉：1.5‑2%，余量为水，各组分以重量百分计，控制pH为6.5‑7.0, 然后在温度121℃、压力0.1Mpa条件下灭菌30min，接种后36℃恒温培养36‑48h；（2）摇瓶培养：培养基配方：酵母粉1‑2%，葡萄糖0.3‑0.7%，磷酸二氢钾0.1‑0.5%，硫酸镁0.05‑0.15%，余量为水，各组分以重量百分计；调pH至7.5后灭菌，接种，37℃摇瓶培养8‑12h，当pH下降至6.5‑6.7时进入种子罐；（3）种子罐发酵：配料A：硫酸铵：3.5kg，脱脂大豆粉：17kg，磷酸二氢钠：13kg，磷酸二氢钾：4.2kg，玉米浆：60kg，硫酸镁：1.39kg，硫酸亚铁：3.06g，硫酸锰：18.2g，硫酸锌：4.8g，消泡剂：1.5kg，在种子罐中121‑123℃条件下灭菌50min；配料B：结晶葡萄糖35kg在另外一罐中121‑123℃灭菌35min，冷却后并入灭菌冷却后的种子罐中，然后将种子罐调整到温度32‑34℃，pH为6.6‑6.8，罐压0.5Mpa，空气流量40m³/h，溶氧100%，定容1m³，然后接种后在温度32‑34℃，pH为6.6‑6.8，罐压0.5Mpa，空气流量40m³/h的条件下发酵20‑30h，当溶氧68‑72%，镜检菌体正常时转入发酵罐；（4）发酵罐发酵：配料A：脱脂大豆粉：180kg，玉米浆：500kg，磷酸氢二钾：175kg，磷酸二氢钾：57kg，硫酸铵：33kg，硫酸镁：0.77kg，硫酸亚铁17g，硫酸锰6.67g，硫酸锌5g，消泡剂：12kg，在发酵罐中121‑123℃灭菌50min；配料B：氯化钙33kg在另一罐中121‑123℃灭菌40min，冷却并入灭菌冷却后的发酵罐中；配料C：结晶葡萄糖70kg在另一罐中121‑123℃灭菌35min，冷却并入灭菌冷却后的发酵罐中；将发酵罐调整到pH为6.6‑6.8，罐压0.4Mpa，空气流量650 m³/h，溶氧100%，定容10m³，接种后在温度38℃，pH为6.6‑6.8，风量650 m³/h，罐压0.4Mpa条件下发酵100‑120h；（5）酶的提取：取发酵醪液，调pH至9.0，然后依次加入醪液体积量2.5‑4%的CaCl₂，2.5‑4%的Na₂HPO₄，稀释2倍后加醪液体积量2%的硅藻土进行絮凝处理，加热至65‑70℃后，经板框压滤、超滤泵超滤后获得滤液，然后向滤液中依次加入干糊精2%、醋酸钠8‑10%、氯化钠18‑22%进行调配，之后用醋酸调节pH至6.0‑6.5，迅速加热至65‑70℃，保持5‑10min，立即冷却，取样测酶活，最终发酵酶可达20000‑40000U/mL，之后用硅藻土进行成品精过滤，装入成品储罐。