[发明专利]一种建立农杆菌介导豆瓣绿转染体系的方法

摘要

本发明公开了一种建立农杆菌介导豆瓣绿转染体系的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：侵染和共培养阶段：将豆瓣绿无菌苗叶片块放入三角瓶中，倒入农杆菌菌液进行侵染，瓶口密封抽真空，侵染后倒去菌液，将叶片晾干，转接到共培养培养基中暗培养得到愈伤组织；筛选阶段：将愈伤组织转接到筛选培养基中筛选得到幼芽；生根阶段：将获得的幼芽转接到生根培养基培养，得到抗性苗；阳性检测阶段：取抗性苗的叶片，进行阳性检测，建立农杆菌介导豆瓣绿转染体系。本发明提供的农杆菌介导豆瓣绿的转化体系，愈伤组织形成频率、分化频率以及转化率都较高，可以满足豆瓣绿育种需求，适合大规模工业生产和商业育种。

主权项

1.一种建立农杆菌介导豆瓣绿转染体系的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：侵染和共培养阶段：将豆瓣绿无菌苗叶片块放入三角瓶中，倒入农杆菌菌液进行侵染，瓶口密封抽真空，侵染后倒去菌液，将叶片晾干，转接到共培养培养基中暗培养；筛选阶段：将共培养后的叶片转接到筛选培养基中筛选得到幼芽；生根阶段：将获得的幼芽转接到生根培养基培养，得到抗性苗；阳性检测阶段：取抗性苗的叶片，提取DNA，进行PCR扩增，将PCR产物进行凝胶电泳，得到农杆菌成功侵染豆瓣绿的阳性苗，建立农杆菌介导豆瓣绿转染体系；所述共培养培养基：SH基础配方+TDZ 0.01~2.5mg•L^‑1+NAA 0.01~2.0mg•L^‑1+IBA 0.01~2.0mg•L^‑1+蔗糖30~60g • L^‑1+葡萄糖 10~60g •L^‑1+琼脂 8~16g •L^‑1+AS 100~300μmol•L^‑1，pH 5.2~5.8，120~125℃灭菌20‑30min；所述筛选培养基成分如下：SH基础配方+TDZ 0.01~2.5mg•L^‑1+NAA 0.01~2.0mg•L^‑1+IBA 0.1~2.0mg•L^‑1+蔗糖30~60g •L^‑1+琼脂 8~16g•L^‑1 +羧苄青霉素 250~750mg•L^‑1 +潮霉素 20~200mg•L^‑1，pH5.2~5.8；所述生根培养基成分如下：SH基础配方+IBA 0.1~1.6mg•L^‑1+蔗糖30~60g•L^‑1+琼脂 8~16g•L^‑1，pH5.2~5.8;其中SH基础配方：硝酸钾2~5.0g•L^‑1，硫酸镁 0.1~0.4g•L^‑1，磷酸二氢铵0.3~0.6g•L^‑1，氯化钙 150~300mg•L^‑1，甘氨酸 2~4mg•L^‑1，肌醇 100~200mg•L^‑1，盐酸硫胺素0.4~0.8mg•L^‑1，盐酸吡哆素 0.5~1.0mg•L^‑1，烟酸 0.5~1.0mg•L^‑1，乙二胺四乙酸铁纳 10~40mg•L^‑1，六水氯化钴 0.1~0.2mg•L^‑1，五水硫酸铜 0.2~0.4mg•L^‑1，硼酸5~10mg•L^‑1，碘化钾 1~2mg•L^‑1，一水硫酸锰 10~20mg•L^‑1，二水钼酸钠 0.1~0.2mg•L^‑1，七水硫酸锌 1~2mg•L^‑1。