[发明专利]一种红肉苹果组培苗生产花青苷的方法

摘要

本发明公开了一种红肉苹果组培苗生产花青苷的方法，操作步骤如下：(1)获取无菌材料、(2)初代培养获得红肉苹果组培苗、(3)继代培养获得大量红肉苹果组培苗、(4)壮苗培养、(5)花青苷的提取和粗品的制备。本发明的实验证明，利用上述方法培养的红肉苹果组培苗，其花青苷含量最高达到359.86U·g^‑1FW，是室温下常规蔗糖培养基上的花青苷含量的7.8倍，分别是5年生红肉苹果结果树花后12周果皮、新叶、花后12周果肉、花的1.8、2.8、2.9、3.6倍，本发明不受时间及原材料缺乏的限制，实现利用组织培养法进行花青苷的工业化生产，为生产花青苷提供了一种新的途径。

主权项

一种红肉苹果组培苗生产花青苷的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)获取无菌材料：选择新疆红肉苹果与富士苹果杂交后获得的果肉鲜红的优系(2010‑15)红肉苹果的新稍茎尖为外植体，用1％吐温(或洗衣粉)水浸泡15min，再用自来水冲洗20min后，于超净工作台上，用75％的酒精浸泡消毒30s，无菌水冲洗1遍，再用0.1％氯化汞溶液浸泡消毒6‑8min，期间不断晃动，使外植体各面均接触到消毒液，最后用无菌水清洗5遍；(2)初代培养获得红肉苹果组培苗：将外植体接种到诱导培养基上，所述诱导培养基以MS为基本培养基，添加1.0mg·L^‑1的6‑BA(苄基腺嘌呤)、0.1mg·L^‑1的IBA(吲哚丁酸)，30g·L‑¹蔗糖，8g·L‑¹琼脂，3g·L^‑1活性炭，4g·L^‑1PVP，培养基pH值为5.8，经121℃高压蒸汽灭菌25min后，分装，待外植体生长成0.6‑1.3cm的小芽时，进行继代增值培养；(3)继代培养获得大量红肉苹果组培苗：将小芽接种到继代培养基上进行增值培养，所述继代培养基成分为MS、1.0mg·L‑16‑BA、0.1mg·L‑1IBA，约10‑20天后，分化出2‑3个丛生芽，25‑35天后，丛生芽长至约2cm，平均4‑5周继代一次，继代培养过程中温度控制在20‑30℃；(4)壮苗培养：取继代培养长势良好的红肉苹果组培苗，接种至以MS为基本培养基，添加1.0mg·L^‑1的6‑BA(苄基腺嘌呤)、0.1mg·L^‑1的IBA(吲哚丁酸)、30g·L^‑1果糖或山梨醇、8g·L^‑1琼脂的培养基上，放置在17℃恒温光照培养箱里进行壮苗培养；(5)花青苷的提取和粗品的制备：选取果糖或山梨醇处理的17℃恒温培养14天后的组培苗，剪碎后用液氮研磨成粉，将得到的粉末置于锥形瓶中，按固液比1:10加入丙酮溶液，将锥形瓶用封口膜封口，置于超声波清洗器中，控制温度在30℃，超声30min后置于黑暗中浸提10小时，得浸提液，将浸提液用连接真空抽气泵的布氏漏斗抽滤，将所得滤液倒入旋蒸瓶，在旋转蒸发仪上以20‑30℃的温度旋蒸去除丙酮溶剂，然后避光静置，再经过抽滤，滤纸上的颗粒即为花青苷粗品。