[发明专利]一种检测结核杆菌实验室终末消毒效果的方法

摘要

本发明提供一种检测结核杆菌实验室终末消毒效果的方法，具体过程为：（1）采集擦拭拭子样本和空气样本；（2）将两类样本分别与无菌生理盐水混合，充分挤压后涡旋混匀；（3）采用DNA基因组提取试剂盒提取两类样本液的完整细菌全基因组核酸样本；（4）以结核分支杆菌复合群特异性插入序列IS6110为靶标，采用Primer5软件设计特异性核酸扩增引物IS6110P；（5）分别将两类样本的完整细菌全基因组核酸样本、上游引物、下游引物、DNA聚合酶及其相应缓冲液、4种dNTP和无菌双蒸水混合进行PCR扩增反应；（6）采用琼脂糖电泳法检测鉴定两类样本的扩增产物，并在凝胶成像仪下观察扩增产物并记录检测结果。

主权项

1.一种检测结核杆菌实验室终末消毒效果的方法，其特征在于按照以下工艺步骤进行：/n(1)采集终末消毒后的实验室中的擦拭拭子样本和空气样本；/n(2)将采集的擦拭拭子样本和空气样本分别与无菌生理盐水混合，充分挤压后涡旋混匀，得到擦拭拭子样本液和空气样本液；/n(3)采用DNA基因组提取试剂盒提取擦拭拭子样本液和空气样本液的完整细菌全基因组核酸样本，过程为：/nS1.取擦拭拭子样本液1mL，加入500μlAHL，室温孵育30min，期间颠倒混匀；/nS2.10000g离心10min，移除上清，保留固体；/nS3.在固体中加入混有2.5μlBenzonase的190μlRDD，于37℃、600rpm的震荡条件下孵育30min；/nS4.加入20μl蛋白酶K，先于3～10℃孵育12～24h，再于56℃、600rpm震荡条件下孵育30min；/nS5.先3000～6000g瞬时离心，再加入200μl含Reagent DX的ATL，然后转移至病原裂解管；/nS6.采用TissueLyser LT在50Hz下或TissueLyser II在30Hz下裂解10min；/nS7.10000g离心1min，充分混合后转移上清至新的离心管中；/nS8.加入40μl蛋白酶K，漩涡混匀，于56℃、600rpm震荡条件下孵育30min；/nS9.加入200μlAPL2，漩涡混匀30s；/nS10.70℃孵育10min，期间颠倒混匀；/nS11.加入200μl无水乙醇，充分混匀15～30s后得到混合物；/nS12.取上述混合物700μl加入到离心柱中，6000g离心1min，弃洗脱液；将剩余混合物再次加入同一离心柱中，6000g离心1min，弃洗脱液；/nS13.将离心柱移入新的离心套管中，加入500μl缓冲液AW1，6000g离心1min后再次移入新离心套管；/nS14.加入500μl缓冲液AW2，15000～20000g离心3～5min，转移离心柱至新离心套管中，15000～20000g离心1～3min；/nS15.将离心柱移入新的微量离心管，直接向离心柱的膜中心加入20～100μlAVE或无菌双蒸馏水，加盖室温孵育3～10min；/nS16.6000～8000g离心1～3min，保留洗脱液，得到擦拭拭子样本的完整细菌全基因组核酸样本；/nS17.将空气样本液按照步骤1～16的过程进行处理，获得空气样本的完整细菌全基因组核酸样本；/n(4)以结核分支杆菌复合群特异性插入序列IS6110为靶标，采用Primer5软件设计特异性核酸扩增引物IS6110P，具体为：/n上游引物序列为IS6110P-F：5'-TACGGTGCCCGCAAAGTG-3'，/n下游引物序列为IS6110P-R：5'-CGCCAGCCCAGGATCCTGCGAGCGT-3'；/n(5)分别将擦拭拭子样本和空气样本的完整细菌全基因组核酸样本、上游引物、下游引物、DNA聚合酶及其相应缓冲液、4种dNTP和无菌双蒸水混合进行PCR扩增反应；/n(6)采用琼脂糖电泳法检测鉴定擦拭拭子样本和空气样本的扩增产物，并在凝胶成像仪下观察扩增产物并记录检测结果。/n