[发明专利]一种用于检测热原的细胞模型的构建方法和细胞模型及热原检测试剂盒

摘要

本发明提供一种用于检测热原的细胞模型的构建方法和细胞模型及热原检测试剂盒。该细胞模型利用CRISPR/CAS9诱导基因组特定位置形成双键断裂，并利用同源重组修复的原理在细胞系的两个染色体分别定点敲入TLR4及CD14‑MD2并以绿色荧光GFP和红色荧光RFP分别示踪最终我们成功构建TLR4/CD14/MD2定点敲入荧光示踪细胞模型，LPS刺激细胞模型可通过ELISA、Western Blot、质谱及磁珠法检测到IL‑6、TNF‑a细胞因子的释放，该细胞模型稳定性好，灵敏性高，最低检测限可达0.005EU/mL，远远低于鲎试剂法的0.025EU/mL。

主权项

1.一种用于检测热原的细胞模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将TLR4基因组装到可表达绿色荧光的表达载体中，构建含有TLR4基因的重组质粒pCAG‑TLR4‑GFP；2)采用CRISPR/CAS9法将TLR4基因定点敲入细胞系一染色体上的一基因的内含子中，获得一稳定表达TLR4基因的细胞系；3)使用两个不同的2A序列T2A和F2A将CD14、MD2和红色荧光RFP基因结构隔开构建含有CD14基因和MD2基因并可表达红色荧光的重组质粒pCAG‑MD2‑T2A‑CD14‑F2A‑RFP；4)采用CRISPR/CAS9法将CD14基因和MD2基因定点敲入步骤2)所获得的细胞系的敲入该TLR4基因的染色体以外的另一染色体上的一基因的内含子中，获得一可稳定表达TLR4基因、CD14基因和MD2基因，并可同时表达绿色荧光和红色荧光的细胞株，即为所述的细胞模型；其中，所述细胞系为HEK293T、HEK293或NIH3T3；所述步骤2)中敲入TLR4基因的位置为第十九号染色体PPP1R12C基因第一位内含子；所述步骤4)中敲入CD14基因和MD2基因的位置为第三号染色体CCR5基因第一位内含子；所述步骤2)的CRISPR/CAS9法的具体步骤为：提取细胞系基因组DNA；构建PPP1R12C基因打靶载体的长臂long arm、短臂short arm；连入pMD19‑T载体获得pMD19‑T‑long arm质粒和pMD19‑T‑short arm质粒；将长臂、短臂分别酶切并连入pMCS.DT‑A打靶载体，得到DTA‑long arm‑short arm质粒；测序；将DTA‑long arm‑short arm质粒和pCAG‑TLR4‑GFP质粒进行双酶切、电泳、回收、连接得到DTA‑short arm‑CAG‑TLR4‑GFP‑long arm打靶载体，电转化到细胞中，观察绿色荧光表达并筛选表达绿色荧光的单克隆；所述步骤4)的CRISPR/CAS9法的具体步骤为：构建CCR5基因打靶载体的长臂long arm、短臂short arm；连入pMD19‑T载体获得pMD19‑T‑long arm质粒和pMD19‑T‑short arm质粒；将长臂、短臂分别酶切并连入pMCS.DT‑A打靶载体，得到DTA‑long arm‑short arm质粒；测序；将DTA‑long arm‑short arm质粒和pCAG‑MD2‑T2A‑CD14‑F2A‑RFP质粒进行双酶切、电泳、回收、连接得到DTA‑short arm‑CAG‑MD2‑T2A‑CD14‑F2A‑RFP‑long arm打靶载体，电转化到步骤2)获得的单克隆中；其中，F2A的序列如SEQ ID No.13所示；T2A的序列如SEQ ID No.14所示；PPP1R12C基因打靶载体的长臂long arm的上游引物序列如SEQ ID No.9所示，下游引物序列如SEQ ID No.10所示；PPP1R12C基因打靶载体的短臂short arm的上游引物序列如SEQ ID No.11所示，下游引物序列如SEQ ID No.12所示；CCR5基因打靶载体的长臂long arm的上游引物序列如SEQ ID No.21所示，下游引物序列如SEQ ID No.22所示，CCR5基因打靶载体的短臂short arm的上游引物序列如SEQ ID No.23所示，下游引物序列如SEQ ID No.24所示。