[发明专利]利用AFLP-DNA指纹图谱鉴定与评价冬虫夏草的方法

摘要

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用AFLP‑DNA指纹图谱鉴定与评价冬虫夏草的方法，其包括以下步骤：(1)获取DNA片段：用内切酶MseI、EcoRI双酶切冬虫夏草标准品及冬虫夏草待测样品的基因组，以获取冬虫夏草标准品及冬虫夏草待测样品的基因组DNA片段；(2)建立连接体系：在DNA片段产物中加入EcoRI接头、MseI接头和T4DNA连接酶，得连接产物；(3)预扩增：将连接产物稀释5‑20倍，加入TaqDNA聚合酶、上样缓冲液、MgCl₂、MseI‑C及EcoRI‑A，在PCR仪上进行预扩增；(4)选择性扩增：将预扩增产物用ddH₂O稀释，加入TaqDNA聚合酶、上样缓冲液、MgCl₂、MseI‑152及EcoRI‑008，在PCR仪上进行选择性扩增。本发明通过基因图谱的方法能够准确鉴别冬虫夏草的真伪。

主权项

1.一种利用AFLP-DNA指纹图谱鉴定冬虫夏草的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：/n(1)获取DNA片段：用内切酶MseI、EcoRI双酶切冬虫夏草标准品及冬虫夏草待测样品的基因组，酶切时间为2-6h，DNA片断集中在100-500bp，以获取冬虫夏草标准品及冬虫夏草待测样品的基因组DNA片段；/n(2)建立连接体系：在DNA片段产物中加入EcoRI接头、MseI接头和T4DNA连接酶，得连接产物；/n(3)预扩增：将连接产物稀释5-20倍，加入TaqDNA聚合酶、上样缓冲液、MgCl₂、MseI-C及EcoRI-A，在PCR仪上进行预扩增，得到冬虫夏草标准品及冬虫夏草待测样品基因组的琼脂糖凝胶电泳效果图；/n(4)选择性扩增：将预扩增产物用ddH₂O稀释，加入TaqDNA聚合酶、上样缓冲液、MgCl₂、MseI-152及EcoRI-008，在PCR仪上进行选择性扩增，得到冬虫夏草标准品及冬虫夏草待测样品基因组AFLP-DNA对比的指纹图谱；/n其中，MseI-C的DNA序列为：5’-GATGAGTCCTGAGTAAC-CTT-3’；/nEcoRI-A的DNA序列为：5’-GACTGCGTACCAATTCA-AAC-3’；/nMseI-152的DNA序列为：5’-GATGAGTCCTGAGTAAC-CTC-3’；/nEcoRI-008的DNA序列为：5’-GACTGCGTACCAATT CA-ACG-3’；/n步骤(1)中酶切体系混合液总体积为20μL，其中包括冬虫夏草标准品或冬虫夏草待测样品基因组700-900ng、10×NEB buffer 1.5-2.5μL、EcoRI5.0 U、MseI5.0 U，35-40℃保温酶切，75-85℃保温15-25min终止反应，立即放于冰上，获得冬虫夏草标准品及冬虫夏草待测样品的基因组DNA片段；/n步骤(2)中连接体系建立的方法为，取酶切体系混合液总体积8-15μL，加入10μmol/LMseI接头1-3μL、10μmol/L EcoRI接头1-3μL、T4DNA连接酶5.0U、10×T4 buffer 5.0μl，于15-20℃连接过夜，连接产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。/n