[发明专利]莴苣在丝核菌毒素定性和定量检测中的应用

摘要

本发明公开了一种莴苣在丝核菌毒素定性和定量检测中的应用，取莴苣鲜叶保湿培养，定性检测丝核菌毒素。取莴苣鲜叶，采用磷素外渗法定量检测丝核菌毒素。莴苣一年四季可以栽培，随时可用于毒素活性测定，可结合磷素外渗法法定量分析毒素活性，是一种方便快捷、省时省力的研究丝核菌毒素活性的定性和定量的方法。为丝核菌毒素定性和定量检测提供了一种新的途径。

主权项

一种莴苣在丝核菌毒素定性和定量检测中的应用，其特征在于：包括丝核菌毒素的定性检测、丝核菌毒素的定量检测、溶液的配制和标准中间液的配制；丝核菌毒素的定性检测：取莴苣鲜叶，放入直径90mm且铺有滤纸的培养皿中，加入10mL灭菌蒸馏水保湿，接种5μL丝核菌粗毒素，以空白培养基提取物作为对照，置于光照培养箱中，温度为28℃，光照黑暗各12h，湿度大于90％，每处理重复3次，3天后观察记录病斑大小；丝核菌毒素的定量检测：采用磷素外渗法：(1)磷标准曲线：分别吸取磷标准溶液(10μg/mL)0.0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL至15mL刻度试管中，然后依次加入2mL钼酸铵溶液、1mL亚硫酸钠溶液、1mL对苯二酚溶液，加蒸馏水定容至10mL，混匀，静置30min，在波长660nm处测定其吸光度，由此计算出回归系数，利用回归方程计算或绘制成校正曲线；(2)测定：取5mL的离心管，分处理和对照两组，对照组离心管加空白培养基提取物溶液3mL，处理组加入毒素液3mL；取莴苣叶片0.10g置于毒素稀释液中，轻微振荡，使其没入处理液中，25℃光照培养箱中保育24h；取浸泡液2mL于离心管中，10000r/min下离心10min；取上清夜0.40mL，依次加入2mL钼酸铵溶液、1mL亚硫酸钠溶液、1mL对苯二酚溶液，加蒸馏水定容至10mL，混匀，静置30min，在波长660nm处，用相应毒素溶液调零，测定其吸光度，并根据测出的吸光度在标准曲线上样品中的磷含量；每处理重复5次；磷素相对外渗率(％)＝(处理磷含量‑对照磷含量)/对照磷含量×100；溶液的配制：[1]15％(V/V)硫酸溶液：取15mL硫酸缓慢加入到80mL水中，并定容至100mL；[2]5％(W/V)钼酸铵溶液：取5g钼酸铵，用15％硫酸溶液稀释至100mL；[3]对苯二酚溶液：取0.5g对苯二酚于100mL水中，溶解后加一滴浓硫酸；[4]20％(W/V)亚硫酸钠溶液：称取20g亚硫酸钠，用蒸馏水溶解并定容至100mL；[5]国家标准物质中心提供：磷标准储备溶液，浓度为1000μg/mL；标准中间液的配制：先要配制磷的储备液，将磷酸二氢钾于105℃干燥2h，干燥器内冷却后称取0.2195g溶于水并稀释至100mL；此储备液1mL含0.5mg总磷；移取储备液10.0mL，用水稀释至500mL，此溶液1mL含0.010mg总磷，使用当天配制；吸取1mL磷标准储备溶液，然后移入100mL容量瓶中，用去离子水定容至100mL，浓度为10mg/L。