[发明专利]一种具有炎症基础的结直肠癌动物模型的建立方法

摘要

本发明提供一种具有炎症基础的结直肠癌动物模型的建立方法，步骤如下：第一步，pBabe‑CMV‑EGFP‑puro质粒的构建；第二步，逆转录病毒介导的EGFP过表达系统的建立；第三步，稳定表达EGFP的结直肠癌细胞系的建立；第四步，A组裸鼠腋下结直肠癌移植瘤模型的建立；第五步，B组裸鼠炎症模型的建立：第六步，具有炎症基础的结直肠癌动物模型的建立：摘除A组裸鼠腋下的肿瘤，用无菌眼科剪剪碎至直径约2mm瘤块，取一瘤块，直接缝合至B组裸鼠结直肠肠壁上，重复第五步中步骤，继续饲养一周，再次重复第五步中步骤，继续饲养一周，即得癌动物模型。本发明的建立的动物模型能够证实肿瘤的存在，并评估肿瘤的大小。

主权项

一种具有炎症基础的结直肠癌动物模型的建立方法，其特征在于步骤如下：第一步，pBabe‑CMV‑EGFP‑puro质粒的构建：1) 通过下列反应体系和条件制备得到pBabe‑puro 酶切产物，其中DNA为pBabe‑puro 质粒，反应体系：DNA，1 μg10×NEbuffer3+BSA，3 μL内切酶BamHI，1单位内切酶EcoRI，1单位加灭菌超纯水至体积30 μL反应条件：37℃水浴2h2) 将pBabe‑puro 酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶并回收含5100 bp大小的DNA片段，并采用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行纯化，得到纯化后的pBabe‑puro 酶切产物，3) 通过下列PCR反应体系和条件制备得到CMV‑EGFP DNA片段，其中DNA模板为pEGFP‑C1质粒，PCR反应体系如下：5×PrimeSTAR Buffer（Mg2+ plus）,10 μLdNTP Mixture（各2.5 mM）,4 μL正向引物1：5'CCGGATCCTAATAGTAATCAATTACGGG3'（10 μM）,1 μL反向引物2：5'AAGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCAT3'（10 μM）,1 μLDNA模板,100 ngPrimeSTAR HS DNA Polymerase（2.5 U/μl）,0.5 μL加灭菌超纯水至体积50 μL反应条件：98℃ 10 sec55℃ 15 sec72℃ 1 min/kbp30 Cycles产物：1400bp4) 将CMV‑EGFP DNA片段采用AxyPrep PCR 清洁试剂盒进行纯化，得到尚未酶切的CMV‑EGFP DNA片段，5) 通过下列反应体系和条件制备得到CMV‑EGFP酶切产物，其中DNA为尚未酶切的CMV‑EGFP DNA片段，反应体系：DNA，1 μg10×NEbuffer3+BSA，3 μL内切酶BamHI，1单位内切酶EcoRI，1单位加灭菌超纯水至体积30 μL反应条件：37℃水浴2h6) 将CMV‑EGFP酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶并回收含1400 bp大小的DNA片段，并采用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行纯化，得到纯化后的CMV‑EGFP酶切产物，7) 采用T4 DNA连接酶和快速连接试剂盒，将纯化后的CMV‑EGFP 酶切产物与纯化后的pBabe‑puro 酶切产物进行连接，得到连接产物，8) 将连接产物转化入感受态大肠杆菌细胞，并进行抗性筛选，得到抗性筛选后的单克隆菌落，9) 将抗性筛选后的菌落进行阳性克隆筛选，得到pBabe‑CMV‑EGFP‑puro质粒；第二步，逆转录病毒介导的EGFP过表达系统的建立：将pBabe‑CMV‑EGFP‑puro质粒与辅助包装原件载体质粒VSVG和pMDL g/p RRE用Lipofectamine 3000转染试剂转染293T细胞，即得逆转录病毒介导的EGFP过表达系统，其中质粒的质量比例如下：pBabe‑CMV‑EGFP‑puro:VSVG:pMDL g/p RRE=2:1:1；第三步，稳定表达EGFP的结直肠癌细胞系的建立：将逆转录病毒介导的EGFP过表达系统加入结直肠癌细胞培养液中，感染细胞，受感染的细胞的EGFP基因可整合至细胞基因组中，形成稳定表达EGFP的细胞，以终浓度4μg/mL嘌呤霉素筛选稳定表达EGFP的细胞，建立得到稳定表达EGFP的结直肠癌细胞系；第四步，裸鼠腋下结直肠癌移植瘤模型的建立：① 将1×10⁷个稳定表达EGFP的结直肠癌细胞系，重悬于DMEM培养液中，调整体积为50μL，细胞密度为1×10⁷/50μL，再与50μL Matrigel等体积混合，得到细胞悬液，至于冰上备用，② 采用胰岛素注射器，将100μL细胞悬液注射入A组裸鼠腋下，2周后即得裸鼠腋下结直肠癌移植瘤模型；第五步，炎症模型的建立：① B组裸鼠禁食24小时，② 根据B组裸鼠体重取用TNBS，加水补至50μL，加入50μL无水乙醇，即配成100μL TNBS工作液，其中每1kg裸鼠取用100 mg的TNBS，③ B组裸鼠用乙醚麻醉，提尾巴促排便，俯卧位，将灌胃针经小鼠肛门轻轻插入结肠，至针管顶端距离肛门4cm处，使小鼠倒立，注入100μL TNBS工作液，使小鼠保持倒立姿态30s，拔出灌胃针，④ 一周后，重复一遍第五步①～③，继续饲养一周，即得炎症模型；第六步，具有炎症基础的结直肠癌动物模型的建立：① 摘除第四步的A组裸鼠腋下的肿瘤，用无菌眼科剪剪碎至直径约2mm瘤块，② 取一瘤块，直接缝合至第五步的B组裸鼠结直肠肠壁上，③ 重复第五步①～③，继续饲养一周，④ 再次重复第五步①～③，继续饲养一周，即在裸鼠体内建立具有炎症基础的结直肠癌动物模型。