[发明专利]一种基于悬浮芯片系统针对灰葡萄孢抗药相关位点的多重检测方法

摘要

一种基于悬浮芯片系统针对灰葡萄孢抗药相关位点的多重检测方法涉及分子生物学领域，具体涉及一种采用悬浮芯片系统，结合ASPE PCR方法针对与4种杀菌剂抗药性相关的灰霉抗药位点多重检测技术。本发明公开了一种基于悬浮芯片系统的针对灰葡萄孢抗药突变位点的多重检测方法。它是依次通过多重PCR、EXO/SAP处理PCR产物、多重ASPR PCR、带有生物素标记的ASPR PCR产物与磁珠杂交、Bio‑Plex 200系统检测五个步骤，来实现同时检测与四类杀菌剂抗药型相关基因型的目的。本发明具有高通量、灵敏度高、特异性好、重复性好、所需样本量少等优点。

主权项

一种基于悬浮芯片系统针对灰葡萄孢抗药相关位点的多重检测方法，其特征在于共分五步：第一步，四重聚合酶链式反应:以灰葡萄孢菌基因组DNA为模板，采用四对引物，在同一反应体系中同时扩增包含抗药突变位点在内的BenA、SdhB、BcOS1、erg27四个基因片段；SEQ ID NO:1GTCGTCCCATCGCCAAAGGT，SEQ ID NO:2ACGGTGACAGCACGGAAAGA用于扩增BenA基因片断；SEQ ID NO:3ACACCGACCCAGCACCAGA，SEQ ID NO:4TTAGCAATAACCGCCCAAA用于扩增SdhB基因片断；SEQ ID NO:5AGGTCACCCGCGTAGCAAGA，SEQ ID NO:6TGCTTGATTTCACCCTTACA用于扩增BcOS1基因片断；SEQ ID NO:7GCGTGGAGAACTCTAAATCGG，SEQ ID NO:8AGTGTAAGGCTTGATGGTATGC用于扩增erg27基因片断。第二步，ExoSAP‑IT处理四重PCR产物，以去除多余的引物及脱氧核苷酸(dNTP)；第三步，多重等位基因特异性扩增反应。该步反应以第二步中的反应产物为模板，加入dATP、dGTP、dTTP和生物素标记的dCTP，反应体系中共包括8条特异性TAG‑ASPE检测引物，每条引物对应一种基因型，最终该步反应的产物会带有生物素标记；多重ASPE反应引物序列为：SEQ ID NO:9CATCTTCATATCAATTCTCTTATTTTGGTTGAGAACTCTGACGA，SEQ ID NO:10ACAATATACATCACTTAAACTTTCTTGGTTGAGAACTCTGACGC，SEQ ID NO:11AACTTTCTCTCTCTATTCTTATTTGAGCAGTTGAGAATAGTGTG，SEQ ID NO:12AATTTCTTCTCTTTCTTTCACAATGAGCAGTTGAGAATAGTGTA，SEQ ID NO:13ATACTTTACAAACAAATAACACACTGCCCTGGACGCCTTCGA，SEQ ID NO:14TCATCACTTTCTTTACTTTACATTTGCCCTGGACGCCTTCGC，SEQ ID NO:15TTCAATTCAAATCAAACACATCATCCATCCATCTTACAAGGTAGA，SEQ ID NO:16ATCTCAATTACAATAACACACAAACATCCATCTTACAAGGTAGG；第四步，将8种偶联有anti‑TAG序列的荧光编码微球混合，不同荧光编码微球上偶联的anti‑TAG序列特异的与ASPE反应产物的TAG序列杂交，反应体系中加入的链酶亲和素‑藻红蛋白，识别微球捕获的PCR产物上的生物素标记；第五步，区分不同颜色的微球并且检测复合物发出的荧光，从而确定目标物的基因型，以此达到高通量的检测目的。检测结果以平均荧光强度展示。检测的八种与灰葡萄孢抗药性相关的基因型分别为：BenA‑E198(GAG)、BenA‑198A(GCG)、SdhB‑H272(CAC)、SdhB‑272Y(TAC)、BcOS1‑I365(ATC)、BcOS1‑365S(AGC)、erg27‑F412(TTC)、erg27‑412S(TCC)。