[发明专利]一种农杆菌介导的紫萍稳定转化体系建立的方法

摘要

本发明公开了一种农杆菌介导的紫萍稳定转化体系建立的方法，其步骤是：A、诱导紫萍愈伤组织；B、目的基因与T载体连接；C、目的基因与植物表达载体连接；D、植物表达载体在根癌农杆菌LBA4404中的转化；E、制备侵染菌液；F、愈伤组织与农杆菌共培养；G、再生及选择培养：叶状体GUS染色结果呈蓝色表明目的基因成功整合入紫萍基因组中，且叶状体组织被染成蓝色的部位就是目的基因表达的部位。通过将目的基因插入植物表达载体后再转入根癌农杆菌LBA4404用于侵染愈伤组织，最后控制抗生素的浓度筛选出阳性植株，得到转基因紫萍，建立的转化体系经过紫萍无性繁殖仍可持续稳定遗传，具有生物安全性和开发应用价值。

主权项

一种农杆菌介导的紫萍稳定转化体系建立的方法，其步骤是：A、诱导紫萍愈伤组织：野生紫萍采用0.1％w/v氯化汞灭菌2‑3分钟后，培养于1/2MS固体培养基中：1％w/v蔗糖、0.6％w/v琼脂、0.5mg/L TDZ、pH 5.8，待长出芽后，转移至1/2MS液体培养基中：1％w/v蔗糖、pH5.8，用作长期保存；取20‑30片叶状体置于愈伤诱导培养基：1/2MS培养基、1％w/v蔗糖、0.6％w/v琼脂、5mg/L 2,4‑D、2mg/L 6‑BA、pH 5.8，诱导愈伤组织，期间每两周更换一次培养基，培养出的绿色松软的愈伤组织用于后续基因转化；B、目的基因与T载体连接：通过PCR扩增目的基因用于后续试验，20μL的PCR扩增体系，包括：模板1μL，dNTPs 0.2mM，引物0.5mM，Easy Taq酶0.2单位，10×buffer2μL，补水至20μL，PCR产物检测方法为：取5‑10μLPCR产物与1‑2μL 6×Loading Buffer混匀后，经1.2％w/v琼脂糖凝胶检测，溴化乙锭染色10‑15min后，凝胶成像仪观察拍照，检测显示为目的基因条带正确，表明成功扩增目的基因DNA；pGEM‑Teasy载体连接试剂盒连接目的基因与pGEM‑Teasy vector，步骤是：(1)10μL体系PCR产物与pGEM‑Teasy vector连接体系，包括：2×rapid ligation buffer 5μL，pGEM‑Teasy vector1μL，PCR product 3μL，T4DNA ligase 1μL，反应体系于4℃过夜；(2)将(1)步骤过夜混合物转化到大肠杆菌DH5α，采用电转化的方法，步骤是：①每50μL大肠杆菌DH5α电转感受态细胞中加入2μL(1)步骤过夜混合物混合物，置于冰上10min，电极杯也提前置于冰上预冷18‑22min；②打开电转移，调节电压为2KV，将(1)步骤过夜混合物转移至预冷的电极杯底部，轻敲击电极杯；③将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后向电极杯中加入800μL SOC液体培养基：2％W/V胰蛋白胨，0.5％W/V酵母提取物，0.05％W/V NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl2，20mM葡萄糖，pH 7.0，重悬细胞后转移至1.5mL灭菌离心管中，置于37℃，180rpm复苏一小时；④准备8μL IPTG(100mg/mL)和40μLX‑gal(20mg/mL)涂布于添加100mg/L氨苄青霉素Ampicillin的固体LB培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L Nacl，6g/L琼脂，pH 7.0，将(3)步骤转化产物于12000rpm离心1min后去上清涂板，37℃过夜培养；⑤挑取3‑5个白斑单克隆置于5mL添加100mg/L氨苄青霉素Ampicillin的液体LB培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L Nacl，pH 7.0，摇菌过夜；⑥采用康为世纪质粒小提试剂盒提取菌液中的质粒后于‑20℃保存，并进行PCR检测和测序分析；C、目的基因与植物表达载体连接：(1)选择植物表达载体种类，采用电转化的方法将植物表达载体转化至大肠杆菌DH5α进行扩增，步骤是：①每50μL大肠杆菌DH5α电转感受态细胞中加入2μL植物表达载体，置于冰上9‑11min，电极杯也提前置于冰上预冷18‑22min；②打开电转移，调节电压为2KV，将(1)步骤过夜混合物转移至预冷的电极杯底部，轻敲击电极杯；③将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后向电极杯中加入800μL SOC液体培养基，重悬细胞后转移至1.5mL灭菌离心管中，置于37℃，180rpm复苏一小时；④将上步转化产物于添加了50mg/L卡那霉素Kanamycin的固体LB培养基涂板，37℃过夜培养；⑤挑取3‑5个单克隆置于5mL液体LB摇菌；⑥采用康为世纪质粒小提试剂盒提取质粒于‑20℃保存；(2)目的基因与植物表达载体连接：目的基因连接至植物表达载体的步骤与连接至T载体相同，步骤是：①根据选择的植物表达载体设计引物，在A步骤获得的目的基因两端加上酶切位点，PCR及电泳鉴定后产物切胶回收纯化，PCR检测；②使用相同的内切酶同时双酶切①步骤的目的基因和植物表达载体，反应体系为：1μLDNA或植物表达载体，1μL内切酶A，1μL内切酶A buffer，1μL内切酶B，1μL内切酶B buffer，补水至20μL，37℃培养至少4h；③将双酶切目的基因产物与双酶切植物表达载体连接，10μL反应体系为：2×rapid ligation buffer 5μL，酶切植物表达载体1μL，酶切目的基因3μL，T4DNA ligase 1μL，反应体系于4℃过夜；④将③步骤过夜混合物电转化的方法转入大肠杆菌DH5α后涂布于添加50mg/L卡那霉素Kanamycin的固体LB培养基，37℃过夜；⑤挑3‑5个单克隆置于5mL液体LB摇菌过夜；⑥采用康为世纪质粒小提试剂盒提取质粒于‑20℃保存，PCR检测；D、植物表达载体在根癌农杆菌LBA4404中的转化：将C步骤中获得的植物载体再转化到根癌农杆菌LBA4404中用于侵染植物，步骤是：(1)每50μL农杆菌LBA4404电转感受态细胞中加入2μL步骤C获得植物载体，置于冰上10min，电极杯也提前置于冰上预冷18－22min；(2)打开电转移，调节电压为2KV，将(1)步骤混合物转移至预冷的电极杯底部，轻敲击电极杯；(3)将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后向电极杯中加入800μL SOC液体培养基，重悬细胞后转移至1.5mL灭菌离心管中，置于28℃，200rpm复苏一小时；(4)离心，去上清后取转化产物于固体YEB培养基：添加20ug/mL利福平Rifampici和100ug/mL壮观霉素Spectinomycin，6g/L酵母提取物、5g/L胰蛋白胨、5g/L葡萄糖、2mM硫酸镁、6g/L琼脂、pH 7.0，涂板；(5)挑取单克隆置于5mL液体YEB：添加20ug/mL利福平Rifampici和100ug/mL壮观霉素Spectinomycin，6g/L酵母提取物、5g/L胰蛋白胨、5g/L葡萄糖、2mM硫酸镁、pH 7.0，摇菌；(6)取2mL菌液分装于4个1.5mL灭菌离心管中按1：1储存于40％v/v甘油，并置于‑80℃保存用于后续试验，剩余菌液采用康为世纪质粒小提试剂盒提取质粒，PCR检测；E、制备侵染菌液：按照平板划线法，蘸取转化的根癌农杆菌LBA4404菌液在添加20ug/mL利福平和100ug/mL壮观霉素的固体YEB培养基上划线，28℃培养2－3天，添加20ug/mL利福平的YEB培养基培养根癌农杆菌LBA4404电转感受态细胞用作空白对照，第2－3天进行继代培养，取根癌农杆菌LBA4404于固体YEB平板上划线培养2－3天后，刮取培养的根癌农杆菌LBA4404菌体至液体YEB混匀，使用biodrop微量核酸蛋白测定仪测得悬浮菌体600nm吸光度OD值为1.0‑1.5时，用于下一步侵染转化；F、愈伤组织与农杆菌共培养：向悬浮根癌农杆菌LBA4404菌体加入100uM乙酰丁香酮混匀备用，选取分裂的紫萍愈伤组织，使用灭菌解剖刀切成直径3‑5mm大小后浸入菌液中28－32min，期间将共培养培养基：1/2MS培养基、1％w/v蔗糖、0.976g/L脂肪酸甲酯磺酸钠MES、5mg/L 2,4‑D、2mg/L 6‑BA、100uM Acetosyringone、pH 5.2，分装于100×15mm灭菌培养皿中，每个皿7‑9mL液体，培养基中放入≥5层灭菌滤纸，以液体培养基浸湿滤纸，且皿中留有0.5‑1mL培养基，最后转移浸泡后的愈伤组织至每个皿中的最上层滤纸，每个皿放6‑8团愈伤组织，24－26℃暗培养3－5天；G、再生及选择培养：4－6天后将上一步共培养后的愈伤组织转移到再生培养基：1/2MS培养基、1％w/v蔗糖、0.6％w/v琼脂、1.32g/L硫酸铵、5mg/L 2,4‑D、2mg/L 6‑BA、300mg/L头孢霉素Cefotaxime sodium、pH 5.8，持续光照下培养3－5天，之后转入选择培养基：1/2MS、1％w/v蔗糖、0.6％w/v琼脂、1.32g/L硫酸铵、0.5mg/L TDZ、300mg/L Cefotaxime sodium、66.67mg/L G418、pH 5.8，进行转化植株的筛选，选择培养至少一个月，每周更换一次培养基，期间，再生出的芽需分离出来置于芽增殖培养基：1/2MS培养基、1％w/v蔗糖、0.6％w/v琼脂、1.32g/L硫酸铵、0.4mg/L 6‑BA、0.1mg/L NAA、150mg/L Cefotaxime sodium、66.67mg/L G418、pH 5.8，以不同转化系区分开培养，芽增殖过程中取不同生长阶段的叶状体检测，每个系单独每次各取8‑10片叶状体分别用于提取基因组进行PCR阳性检测，以及GUS染色检测；GUS染色过程如下：将样品浸泡在GUS染液真空抽气1h，37℃过夜，之后用40％v/v乙醇进行脱色，叶片变白后置于储存液保存，GUS基因产物为水解酶：β‑葡萄糖苷酸酶，组织细胞发生了GUS基因的转化，并表达出GUS基因活性，将X‑Gluc水解生成蓝色产物，它使具GUS基因活性的部位或位点呈现蓝色，根据染色深浅反映出GUS活性，GUS染色结果呈蓝色表明目的基因成功整合入紫萍基因组中，叶状体组织被染成蓝色的部位就是目的基因表达的部位。