[发明专利]一种基于锚定‑粘合机制的蛋白质多层定向固定化方法

摘要

一种基于锚定‑粘合机制的蛋白质多层定向固定化方法，属于生物工程领域。该方法包括步骤：(1)利用克隆的粘合域与纤维素结合域构建长度可控的重组支架蛋白；(2)构建含有锚定域的固定化蛋白，通过锚定域与粘连域之间的生物亲和作用实现该蛋白质与支架蛋白的特异性吸附；(3)利用纤维素结合域与纤维素亲和作用实现单一纤维素表面的蛋白质复合体多层、定向、比例可控式自组装。本发明所具有的优点在于：实现了蛋白质的精确定向化，保证该蛋白活性中心在固定化之后的完整性；通过支架蛋白不仅可以大量地提高固定化蛋白质的数量，而且能够通过调控支架长度来改变固定化蛋白质的数量，这为构建高效率、低成本的多蛋白复合体催化体系提供了一种可行的方法。

主权项

一种基于锚定‑粘合机制的蛋白质多层定向固定化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)支架蛋白与固定化蛋白质的结构设计、分子改造和生物制备，具体包括：①支架蛋白与固定化蛋白质的结构和功能设计：支架蛋白由1‑12个粘合域结构组成而且没有催化活性；固定化蛋白质碳末端添加锚定域结构，使得能够亲和识别粘合域。②锚定域基因与粘合域基因的分子克隆。③拼接1‑12个不同数量的锚定域基因构成了不同长度的支架蛋白，然后在支架蛋白碳末端插入纤维素结合域CBM基因和氮末端添加组氨酸标签，最后是支架蛋白的微生物可溶性胞内表达验证以及支架蛋白的分离纯化。⑤固定化蛋白质的基因修饰，即在该蛋白氮末端插入锚定域基因构建新的融合蛋白，为了保证该融合蛋白的可溶性表达因此在固定化蛋白和锚定域中间插入GS‑Linker短肽，最后是固定化蛋白质的微生物胞外分泌表达以及其验证该融合蛋白是否与支架蛋白发生特异性亲和吸附作用。(2)固定化前对载体进行表面封闭处理，目的是封闭载体表面微孔隙防止支架蛋白的非特异性吸附。具体操作是将载体分散在质量浓度为1％牛血清蛋白溶液中，在20℃条件下振荡1h，然后离心除去上清液，并用pH 8.0Tris‑Hcl缓冲液洗涤三次。(3)支架蛋白与载体的亲和吸附，形成载体‑支架蛋白自组装体。具体操作是将表达纯化后不同长度的支架蛋白与封闭处理后的载体在20℃条件下进行振荡混合12h，然后离心除去上清液，并用pH8.0Tris‑Hcl缓冲液洗涤三次。(4)固定化蛋白与载体‑支架蛋白的亲和固定吸附，最终进行多蛋白的自组装体系。具体操作是将载体‑支架蛋白与表达纯化后的固定化蛋白质在4℃条件下进行振荡混合12h，并且添加终浓度为10mM的氯化钙促进固定化蛋白质的吸附，然后离心除去上清液，并用pH8.0Tris‑Hcl缓冲液洗涤三次。